والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica

الهدف الرئيسي من هذا الإجراء هو تقديم بروتوكول توصيف جيني جزيئي سريع وفعال من حيث التكلفة، يمكنه التمييز بين أصناف Retta cylindrica، والتي تُسمى عادةً عشب الغون، والتي لا يمكن تمييزها من خلال المورفولوجيا وحدها. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحديد وعزل الأنسجة من صنف عشب الغون المستهدف. والخطوة التالية هي استخلاص الحمض النووي النووي والبلاستيدي من الأنسجة التي تم جمعها.

بعد ذلك، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي DNA المستخلص باستخدام بادئات متخصصة في الأصناف تستهدف الاختلافات التسلسلية في منطقة turn LF في PLAs، بالإضافة إلى ضوابط إيجابية وسلبية مناسبة. والخطوة النهائية هي إجراء الرحلان الكهربائي للهلام على كل من تفاعلات PCR الأربعة لتصور نواتج PCR المضخمة. وفي النهاية، يتم تحديد صنف عشب gon الذي تم جمعه من خلال تحليل حزم نواتج PCR المتخصصة في الأصناف الناتجة على الهلام. تكلف النباتات الغازية الولايات المتحدة حوالي 3.4 مليار سنوياً، مما يتسبب في أضرار جسيمة لكل من الموارد الزراعية والطبيعية.

يعد النوع البري من عشب *Imperata cylindrica*، والمعروف أيضاً باسم عشب كوجان، واحداً من أسوأ 10 أعشاب ضارة غازية في العالم. يشكل عشب كوجان انتشاراً سريعاً في مجموعات أحادية تحل محل النباتات الأصلية، وبالتالي، الحيوانات التي تعتمد على تلك النباتات الأصلية. يجتاح عشب كوجان حالياً 490 مليون هكتار في جميع أنحاء العالم وحوالي 500,000 هكتار في الولايات المتحدة. ويتم تسويق صنف زخرفي من *I. cylindrica* على نطاق واسع تحت أسماء *I. cylindrica* وArbra وred Baren وJapanese blood grass، والذي سنسميه JBG. ويُفترض أن هذا الصنف عقيم وغير غازٍ، ويعتبر مرغوباً بسبب أوراقه ذات اللون الأحمر.

في ظل ظروف معينة، يمكن لعشب الدم الياباني أن ينتج بذوراً قابلة للحياة ويعود إلى شكل أخضر بالكامل لا يمكن تمييزه عن عشب كوجان البري. وكما تلاحظون، يمتلك كلاهما أوراقاً خضراء وهما أكبر حجماً من الصنف الزخرفي التقليدي وبأوراق أكبر. بالإضافة إلى ذلك، تمتلك النباتات المرتدة والبرية ريزومات أكبر، بينما يزيد الصنف الزخرفي من إمكاناته في التكاثر اللاجنسي.

يجعل الارتداد عملية التحديد عبر المورفولوجيا وحدها مهمة شاقة. وتوفر الطرق الجزيئية وسيلة للتمييز بدقة بين النباتات الغازية والمواد النباتية التي لا يمكن تحديدها من خلال الوسائل البصرية العادية.

تعد الطرق الجزيئية بالغة الأهمية للحماية من انتشار وإدخال النباتات الغازية. ويوفر تطبيق هذا البروتوكول الجزيئي وسيلة للتمييز بدقة بين النباتات المرتدة من عشب الدم الياباني وعشب كوغان. ويمكن لهذا البروتوكول أن يساعد في منع التواجد المشترك مع عشب كوغان والتشكل المحتمل لهجائن قابلة للحياة.

تتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية مقارنةً بالتقنيات الموجودة حالياً، مثل تحليل تعدد أشكال طول القطع المضخمة (AFLP) وتقنيات تسلسل الحمض النووي (DNA sequencing)، في كونها توفر تقنية توصيف جيني جزيئي سريعة وفعالة من حيث التكلفة، ويمكنها بسهولة تمييز الفرق بين عشب كوغان (kogan grass) من النوع البري وأصناف عشب الدم الياباني (Japanese blood grass). سيقوم جوزيف هيري، وهو طالب جامعي من مختبرنا، بتوضيح هذه التقنية. أولاً، حدد عينة من موقع ينمو فيه عشب كوغان أو عشب الدم الياباني وتتطلب التمييز بينهما.

يمكن تمييز عشب الدم الياباني بسهولة عن عشب غون من النوع البري من خلال أوراقه ذات اللون الأحمر الزاهي. ومع ذلك، فإن عشب الدم الياباني المرتد يكاد لا يختلف عن عشب كوغان، حيث يمتلك كلاهما أوراقاً خضراء أطول، ومساحة ورقية أكبر، وجذامير أكبر مقارنة بعشب الدم الياباني الزيني. يمكن استخدام هذه الطريقة على أنسجة الأوراق الطازجة والمجمدة والمجففة حديثاً.

في حال تخزين الأنسجة لاستخلاص الحمض النووي DNA في وقت لاحق، فإن أفضل طريقة هي تجميد النسيج وتخزينه عند درجة حرارة 80- درجة مئوية فوراً. أما إذا كان التخزين الجاف ضرورياً، فيوضع النسيج في مظروف ورقي ويُحفظ المظروف في هلام السيليكا المجفف أو غيره من المواد المجففة النشطة في درجة حرارة الغرفة. وفي حال استخدام أنسجة طازجة، يجب التأكد من استخلاص الحمض النووي DNA خلال ثلاث ساعات من عملية الجمع لمنع التحلل.

تستخدم هذه العملية مجموعة أدوات استخلاص الحمض النووي المصغرة للنباتات DNEZ من شركة Kyogen وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديل بسيط واحد. هنا، تم تكييف الإجراء بحيث يتم استخدام أكثر من 100 مليجرام من الأنسجة الطازجة أو المجمدة، أو أكثر من 20 مليجرام من الأنسجة المجففة. أولاً، يتم طحن أكثر من 100 مليجرام من أنسجة الأوراق الطازجة أو المجمدة، أو أكثر من 20 مليجرام من أنسجة الأوراق الجافة، لتحويلها إلى مسحوق ناعم باستخدام ثلاث دورات من النيتروجين السائل مع الطحن في هاون ومدقة مبردة.

قم بوزن المسحوق المجمد من الأنسجة الطازجة أو المجمدة في حصص قدرها 100 mg. أما في حالة استخدام أنسجة الأوراق الجافة، فيتم وزن المسحوق في حصص قدرها 20 mg. بعد هذه الخطوة، باشر عملية استخلاص الـ DNA وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام مقياس طيف ضوئي مثل اختبار NanoDrop spectrophotometer؛ حيث يجب أن تتراوح كميات الـ DNA الجيدة ذات الجودة العالية بين 50 و150 ng/µL، مع نسب 260/280 و230/280 قريبة من 2.0 كما هو موضح هنا.

قم بإجراء الفصل الكهربائي باستخدام هلام 1%AROS قياسي. تحقق من وجود حزم كبيرة نسبياً تزيد عن 10 KB مع عدم وجود تلطخ أو وجود تلطخ طفيف ناتج عن تلوث RNA؛ وفي حال كان تركيز DNA مرتفعاً، قم بتخفيف العينات إلى 70 nanograms per microliter للخطوات اللاحقة. تستند بادئات PCR المستخدمة في هذا البروتوكول، والمشار إليها بالأسهم الحمراء والخضراء، إلى الاختلافات في التسلسل بين منطقة LF spacer في عشب Cogan والأنماط الجينية لعشب الدم الياباني.

تظهر هذه الاختلافات على شكل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة وعمليات إدراج وحذف يشار إليها بالأسهم السوداء الرأسية، مما يسمح بتطوير بادئات خاصة بكل صنف. ومن خلال وضع البادئات في مواقع التسلسلات الفريدة، يتم إدراج تسلسلات البادئات في الجزء المكتوب من البروتوكول؛ لكل مجموعة من عينات DNA المعزولة، قم بإعداد تفاعلين PCR بحجم 50 µL في أنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 0.2 mL على الثلج، وذلك باستخدام كل مجموعة بادئات وفقاً للبروتوكول المكتوب. في حال كان تركيز DNA منخفضاً، يمكن إضافة المزيد من DNA إلى كل تفاعل مع ضبط كمية الماء المقطر مرتين والخالي من النوكلياز بحيث يظل الحجم الإجمالي للتفاعل 50 µL.

لا تستخدم أكثر من 5 µL من الـ DNA أو 10% من الحجم الإجمالي لكل تفاعل، حيث إن الشوائب الموجودة في عينات الـ DNA قد تثبط تفاعلات PCR؛ وللتأكد من أن جميع كواشف PCR تعمل، قم بإعداد الضابط الموجب. وباستخدام بادئات الضابط الموجب، قم بإعداد الضابط السالب باستخدام نفس مجموعة بادئات الضابط الموجب، ولكن باستخدام الماء المقطر المزدوج بدلاً من الـ DNA المستخلص؛ وفي هذه المرحلة، يكون هناك إجمالي أربعة تفاعلات PCR لكل عينة يتم اختبارها. بعد ذلك، قم بإجراء تضخيم PCR في جهاز دوري حراري مزود بغطاء مسخن باستخدام معاملات دورات PCR المذكورة في البروتوكول المكتوب؛ قد يلزم تحسين درجة حرارة التلدين للبادئات، وأوقات التمديد، وعدد الدورات بناءً على جودة الـ DNA أو البادئات أو إنزيم Taq polymerase أو نوع الجهاز الدوري الحراري المستخدم.

بمجرد اكتمال تفاعلات PCR، افصل نواتج PCR على هلام بتركيز 1% باستخدام الرحلان الكهربائي القياسي. قم بتشغيل العينات بجهد كهربائي يبلغ حوالي 120 فولت حتى تصل جبهة الـ DNA إلى ثلاثة أرباع الطول الإجمالي للهلام. قم بتصوير الهلام تحت الأشعة فوق البنفسجية وافحص الحزم الناتجة للتأكد من تضخيم قطعة DNA مناسبة.

يوضح هذا الهلام التمثيلي نتائج الرحلان الكهربائي لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المستخلصة من عينات الحمض النووي لعشب كوجان، وعشب الدم الياباني، وعشب الدم الياباني المرتد، مدمجة مع بادئات متخصصة لعشب كوجان وعشب الدم الياباني (JBG)، بالإضافة إلى عينة الضابط الموجب turn LF وعينة الضابط السالب بدون قالب. تعمل مجموعة بادئات الضابط الموجب turn LF بشكل متساوٍ مع عشب كوجان، وعشب الدم الياباني، وعشب الدم الياباني المرتد، والأنواع الأخرى من الأعشاب، وتؤدي إلى ظهور حزمة بطول 890 زوجاً قاعدياً. وإذا كانت جميع كواشف تفاعل PCR خالية من الملوثات الحمضية النووية، فلن ينتج عن تفاعل الضابط السالب أي ناتج PCR.

إذا كانت عينة DNA مشتقة من عشب كوجان (kogan grass) من النوع البري، فإن تفاعل PCR باستخدام مجموعة البادئات الخاصة بعشب كوجان سينتج حزمة واحدة عند حوالي 595 زوجاً قاعدياً، بينما لن ينتج عن البادئات الخاصة بـ JBG أي حزمة. وبالمثل، إذا كانت عينة DNA مشتقة من JBG أو من تفاعل J-B-G-A-P-C-R المرتد، فإن استخدام مجموعة البادئات الخاصة بـ JBG سينتج حزمة واحدة عند حوالي 594 زوجاً قاعدياً، بينما لن تنتج البادئات الخاصة بعشب كوجان أي حزمة.

نظرًا لأن JBG و JBG المرتد لديهما تتابع أحماض نووية متماثل، فسيكون لهما بالتالي أنماط نطاقات متماثلة. ومع ذلك، فإن الاختلافات المورفولوجية بين JBG ومرتديات JBG واضحة تمامًا، لذا فبينما ستكون نتائج PCR هي نفسها، يسهل تمييز أصناف JBG على مستوى النبات. ويمكن لتسلسل DNA لنواتج PCR تحديد التغييرات المحتملة في تتابعات DNA لمختلف الأنماط البيئية لعشب كوغان.

يوفر تطوير هذه التقنية أول طريقة جزيئية مبسطة يمكنها التمييز بدقة بين النوع البري من K and grass والشكل المرتد من صنف الزينة الخاص به Japanese blood grass. ونحن نشجع مستخدمي هذا البروتوكول على التواصل معنا للإبلاغ عن النتائج المستمدة من استخدام هذا البروتوكول؛ حيث ستساعد هذه المعلومات المشتركة في توفير بيانات حول توزيع Japanese blood grass.

سيساعد هذا أيضاً المسؤولين الرقابيّين في وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) على اتخاذ قرارات مدروسة بشأن الإجراءات التي قد تكون ضرورية للحد من انتشار وأشهر احتمالات التهجين لأصناف عشب Cogan الغازية للغاية.