وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق مجموعة من الخلايا السلفية العصبونية المنقاة من عقد الجهاز العصبي المحيطي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح العضو أو عقد محددة ذات صلة من أجنة الفئران. ثم يتم تفكيك الأنسجة جزئيًا لتحرير الخلايا الفردية في الوسط المحيط.

بعد ذلك، يتم ترشيح معلق الخلايا لإزالة أي كتل نسيجية متبقية أو تجمعات كبيرة. وأخيرًا، يتم فرز معلق الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي لعزل المجموعة المستهدفة بناءً على تعبير مراسل فلوري في تلك المجموعة الخلوية. وفي نهاية المطاف، يمكن مقارنة أنماط التعبير الجيني بين الخلايا السلفية، التي عُزلت في مراحل نمو مختلفة، أو بين مجموعات منقاة من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بعزل المجموعات الخلوية استناداً إلى الوسم بالأجسام المضادة في أن الكواشف المناعية غالباً ما تكون غير متوفرة لوسم الخلايا التي تعبر عن جين معين، حيث تتيح سلالات الفئران المعدلة وراثياً التي تنتج بروتيناً فلورياً في مجموعات عصبية محددة عزل هذه المجموعات الخلوية. وبينما نستعرض هذه الطريقة لعزل الخلايا العصبية السلفية من الأمعاء والمسار العصبي للفم، فإنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة نماذج أخرى تعبر عن مراسلات فلورية.

بشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات لأنهم يميلون إلى الإفراط في هضم الأنسجة المصدر، مما يؤدي إلى فقدان حيوية الخلايا. قبل البدء في عملية التشريح، قم بفحص الأجنة باستخدام إضاءة المجال الساطع للتأكد من أن الهياكل ذات الصلة في بؤرة التركيز. بعد ذلك، حدد الأجنة الإيجابية للجين المنقول من خلال فحص تعبير المراسل الفلوري باستخدام مجهر ستيريو فلوري.

بعد القتل الرحيم، نبدأ بالتعامل مع الأجنة عن طريق إضافة كمية ضئيلة من PBS إلى طبق التشريح، وذلك لمنع الجنين من الطفو أثناء تشريح الأنسجة. افتح جلد الجنين على طول جانبي الجسم وعبر البطن عند مستوى الكبد. اقلب الجنين على ظهره واستخدم ملقطاً دقيقاً لتثبيته في مكانه.

عند مستوى الطرف الأمامي، أدخل زوجاً آخر من الملاقط عند مستوى الحجاب الحاجز، ثم اسحب الأعضاء الداخلية بسرعة نحو الذيل وبعيداً عن الجدار الظهري للجسم لإزالة الأحشاء من الكبد وصولاً إلى الحدبة التناسلية. إذا خرجت أي أعضاء من التجويف الصدري، مثل القلب أو الرئتين، ملتصقة بالأحشاء، فقم بإزالتها قبل المتابعة.

بمجرد فصل الأحشاء البطنية عن الجثة، أدخل ملقطاً أسفل الكبد، بالقرب من المعدة، وافصل الكبد بلطف عن الأمعاء. بعد ذلك، قم بتشريح الأمعاء الخلفية بعناية بعيداً عن الإحليل الظهري وأزل الأمعاء من المسالك البولية التناسلية. وأخيراً، اقلب الأمعاء بحيث يصبح الطحال مرئياً أسفل المعدة.

قم بإزالة الطحال والبنكرياس. باعد بين عرى الأمعاء عن طريق الإمساك بالمساريق. بعد ذلك، قم بنزع المساريق والأوعية الدموية المرافقة من الأمعاء عن طريق سحب المساريق برفق.

تجنب الإمساك بالأمعاء مباشرة باستخدام الملقط. وفي حال تمزق الأمعاء، قم بتجميع القطع المنفصلة معاً عند مرحلة التفكيك. اجمع كل نوع من الأنسجة معاً في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter يحتوي على HBSS مبرد بالثلج، وذلك وفقاً لنوع النسيج ونوع النمط الظاهري للجنين.

بعد عملية الترسيب، يتم سحب أكبر قدر ممكن من محلول HBSS من الأنسجة التي تم تشريحها جزئياً. ثم يتم إعادة تعليق كتلة الأنسجة المترسبة في ملليلتر واحد إلى عدة ملليلترات من ACU max، مع تغيير رؤوس الماصة بين كل عينة وأخرى.

لتجنب التلوث الخلطي بين أنواع الأنسجة، ضع الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 45 دقيقة. وبناءً على مرحلة النسيج الجاري عزله، يعد تفكيك النسيج وترشيحه الجزء الأكثر دقة في الإجراء لمنع التفكك المفرط للنسيج، وما يترتب على ذلك من انخفاض في حيوية الخلايا.

قم بتقييد وقت التفكيك ولا تحاول تفكيك جميع قطع الأنسجة بالكامل في منتصف العملية. وفي نهاية وقت التفكيك، قم بتفتيت الأنسجة يدويًا عن طريق طرق الأنبوب بقوة ضد جانب حمام الماء وتحريك الأنبوب للأسفل بحركة سريعة وخاطفة من المعصم. الآن، انقل العينات المفككة إلى الثلج وأضف فورًا 1 mL من سائل الإخماد (quench) المحضر حديثًا إلى كل أنبوب باستخدام طرف ماصة جديد لكل عينة، ثم قم بسحب العينة للأعلى والأسفل حتى يتم تفكيك الأنسجة بشكل شبه كامل.

الآن، باستخدام زوج من الملاقط المعقمة بالإيثانول، ضع مربعاً بمقاس ثلاثة سنتيمتر من غشاء نايلون شبكي بمسامية 38 ميكرون فوق فوهة أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر. ثم استخدم رؤوس ماصات ضيقة القطر لترشيح محلول الخلايا المعاد تعليقها الفردي عبر الشبكة عن طريق السحب والضخ في مركز الغشاء. وبمجرد ترشيح معلق الخلايا، اشطف أنبوب العينة بـ 1 ملليلتر من quench 1:5 وقم بترشيح أي خلايا متبقية.

ثم قم بإزالة الغشاء مع الحرص على منع دخول أي عينات أنسجة غير مصفاة إلى الأنبوب. وبعد تجميع الخلايا في كريات، قم بشفط السائل الطافي من معلقات الخلايا وأعد تعليق الكرية في 1 mL من محلول quench 1-5. ثم قم بتصفية كل معلق خلوي عبر شبكة نايلون في أنابيب بوليسترين سعة 5 mL كما هو موضح تماماً.

ابدأ بحجز كمية صغيرة من عينة الفلورسنت لتكون بمثابة تحكم تعويضي لـ EGFP فقط. ثم قسّم عينة نسيج النوع البري إلى جزأين، مع تسمية أحدهما "النوع البري فقط" والآخر "seven A a d.Only". الآن، املأ جميع أنابيب العينات بـ quench 1-5، وبعد تجميع العينات بالترسيب، اشفط كل السائل العلوي باستثناء آخر 200 µL في كل أنبوب.

وأخيراً، أضف 7-AAD إلى العينات المراد فرزها وإلى عينة الضابطة التي تحتوي على 7-AAD فقط. ثم أضف 0.75 milliliters من triazole LS إلى أنابيب جمع العينات في جهاز الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 milliliter. ابدأ باستخدام العينات الضابطة لضبط معاملات التعويض والبوابات لتجنب الخلايا الميتة الموجبة لـ 7-AAD وجمع الخلايا التي تظهر شدة عالية من فلورية GFP.

بعد ضبط معلمات التعويض، ابدأ عملية الفرز بأقل ضغط ممكن باستخدام فوهة واسعة القطر ومعدل تدفق منخفض. اجمع بحد أقصى 25,000 خلية في كل أنبوب طرد مركزي دقيق لضمان عدم تخفيف triol LS بشكل مفرط. فور الانتهاء من الفرز، قم برج كل أنبوب يحتوي على الخلايا التي تم التقاطها في triol ls باستخدام جهاز المرج (vortex).

يظهر في هذا الشكل الأول الجهاز التناسلي لجنين أوروبي (Euro) كامل التركيب في اليوم 15.5 بعد الإخصاب، كما يُرى من الجهة البطنية تحت إضاءة المجال الساطع. وتظهر العينة نفسها تحت إضاءة فلورية لتوضيح توزيع الخلايا الموجبة لـ EGFP في الغدة الكظرية والعقد الزلاقيّة الموجودة إنسياً، كما تم تحديدها من خلال تعبير الجين المنقول TH EGFP. ويظهر هذا العرض الجانبي للمثانة التي تم تشريحها جزئياً في اليوم 15.5 بعد الإخصاب في سلالة TH EGFP وميضاً ناتجاً عن تعبير الجين المنقول في العقد الحوضية، وجدار المثانة، والإحليل.

في هذا المنظر الظهري، تظهر الخلايا الموجبة لـ EGFP بوضوح في أنسجة الإحليل الظهرية الأمامية؛ حيث يمثل تفكيك الأنسجة لإنتاج معلقات خلوية من أجل الفرز التدفقِي توازناً دقيقاً بين الهضم الإنزيمي الكافي وتجنب الهضم المفرط الذي قد يؤدي إلى انخفاض حيوية الخلايا. وتظهر هذه الصور المجهرية أنسجة المسالك البولية التناسلية السفلية والأنسجة المعوية في منتصف وقت التفكيك. وكما يتضح في هذه الصور للأنسجة المهضومة بشكل مناسب قبل وبعد التقطيع اليدوي، تظل قطع صغيرة من الأعضاء المفككة جراحياً واضحة تماماً في الأنسجة التي عولجت إنزيمياً لفترة طويلة جداً أو بتركيز إنزيمي مرتفع للغاية.

ومع ذلك، فإن المعلق الناتج يخلو من أي قطع نسيجية كبيرة متبقية؛ حيث يؤدي التفكيك المناسب والترشيح اليدوي إلى إنتاج ملفات تعريف للتدفق الخلوي تظهر عادةً خلايا حيوية بنسبة تزيد عن 90%، وتلك الخلايا التي تعبر عن المراسل في هذه المجموعة الحيوية تحتفظ بتعبير قوي عن EGFP. تتكون المجموعة السوداء من خلايا مفردة ميتة تم وسمها عن طريق امتصاص صبغة الفلورسنت 7-AAD. أما المجموعة الرمادية فتتكون من خلايا مفردة، بناءً على التشتت الأمامي والجانبي، والتي استبعدت 7-AAD، وبالتالي فهي خلايا حيوية.

تأتي المجموعة الخضراء من المنطقة المحددة التي تظهر إيجابية لـ GFP، وتتكون من خلايا حية مفردة استبعدت سبعة A a d، وتظهر فلورية EGFP. وباستخدام هذا الإجراء، يمكن إجراء عزل للطلائع العصبونية من أنسجة محيطية أخرى مثل السلسلة الودية، أو الجذر الظهري، أو العقد، أو الرئة، وذلك للإجابة على تساؤلات حول الاختلافات في أنماط التعبير الجيني بين المجموعات أو حول تطور سلالات متميزة.