تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا

يهدف هذا الإجراء إلى تنقية النطاق داخل الخلوي للبروتين السلف للأميلويد، والمعروف أيضاً باسم A ICD، وتقديم بروتوكول للتجميع الحراري وتوصيف A ICD باستخدام مجهر القوة الذرية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن اندماج A GST لـ A ICD في البكتيريا. بعد ذلك، يتم تنقية بروتين G-S-T-A-I-C-D ثم شطره باستخدام الثرومبين لفصل GST عن A ICD، ومن ثم إزالة GST.

بعد ذلك، يتم تحفيز التجميع الحراري لـ A ICD. وفي الختام، يتم تصوير تجمعات A ICD باستخدام مجهر القوة الذرية. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر إمكانية تنقية A ICD لدرجة التجانس وبكمية كافية للتحليل الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، التي تتطلب خطوات استشراب معقدة، في إمكانية عزل ICD عالي النقاء والذوبان على طاولة المختبر باستخدام كواشف ومعدات قياسية. ويعتبر ICD الناتج عن هذا البروتوكول مناسبًا لمزيد من التوصيف الكيميائي الحيوي والفيزيائي الحيوي.

ستقوم أمينة تي بتوضيح الإجراء. وسيقوم الدكتور أندريس أوبرير، وهو زميل ما بعد الدكتوراه سابقاً في مختبري، بتوضيح كيفية إجراء التصوير بالمجهر القوة الذرية لـ A ICD للتعبير عن النطاق داخل الخلوي لبروتين A PP المؤتلف أو A ICD. ابدأ بخلايا BL 21 المحولة بنواقل pgx 41، والتي تحمل A ICD البشري المدمج مع الطرف الكربوكسيلي لـ GST؛ وباستخدام مستعمرة واحدة، قم بتلقيح 10 milliliters من مرق LB مع الأمبيسيلين وتحضينها طوال الليل عند 37 degrees Celsius مع الرج القوي في صباح اليوم التالي.

قم بتحضين 400 milliliters من وسط LB ampicillin في دورق سعة لتر واحد مع خمسة milliliters من المزرعة التي تم تحضينها طوال الليل. يتم التحضين عند 37 درجة Celsius معرج رج vigorous حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.4 إلى 0.6. وعادة ما يستغرق ذلك من ساعتين إلى 2.5 ساعة لتحفيز تعبير G-S-T-A-I-C-D.

نقوم بإضافة 0.4 millimolar من IPTG ونحضن المزيج عند 37 degrees Celsius مع الرج القوي لمدة خمس ساعات. يتم طرد الخلايا مركزياً عند 6, 000 ×g لمدة 15 دقيقة عند 4 degrees Celsius، ثم يتم تخزين الراسب عند -80 degrees Celsius. بعد تحضير محلول التحلل المنظم (lysis buffer) ووضع البكتيريا على الثلج، يُضاف 20 milliliters من المحلول المنظم إلى الراسب، ويُمزج جيداً باستخدام المزيج بين جهاز الرج الدوامي (vortexing) والتقليب على الثلج بواسطة الماصة.

قم بتعليق الراسب البكتيري، ثم مرر ناتج تحلل البكتيريا المعلق عبر جهاز استحلاب أو مكبس فرنسي (French press) مبرد مسبقاً. عند ضغط 30,000 PSI، مرر ناتج التحلل عبر جهاز الاستحلاب مرة ثانية واجمع ناتج التحلل في أنبوب سعة 50 مل مبرد مسبقاً. قم بطرد ناتج التحلل مركزياً بسرعة 15,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة.

افصل السائل العلوي وانقله إلى أنبوب سعة 50 milliliter مبرد مسبقاً. أضف 500 µL من ملاط glutathione agarose بتركيز 50%. قم بالتدوير لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع استمرار دوران العينة.

قم بتحضير محلول استخلاص (elution buffer) طازج بعد فترة التحضين. صبّ المستخلص والمعلق في عمود كروماتوغرافيا من البوليسترين مخصص للاستخدام مرة واحدة وبطول خمس بوصات مع مرشحات خشنة. اغسل العمود خمس مرات باستخدام 3 mL من PBS.

أغلق الجزء السفلي من العمود وأضف 500 µL من محلول الاستخلاص المنظم في درجة حرارة الغرفة. أغلق الجزء العلوي من العمود وقم بتدويره لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اجمع النضحة الأولى في أنبوب ميكروي مبرد سعة 1.5 mL.

كرر عملية الاستخلاص مرتين إضافيتين. قم بـديلزة المادة المستخلصة باستخدام غشاء ديلزة بحد قطع للوزن الجزيئي 10,000 في أربعة لترات من PBS طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، قم بالديلزة مقابل أربعة لترات إضافية من PBS عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة.

أخرج البروتين من كاسيت الديلزة وأجرِ اختباراً لتقدير كمية البروتين لتحديد إنتاجية G-S-T-A-I-C-D. وعادةً ما تؤدي عملية التنقية من 400 milliliters من المزرعة إلى الحصول على إنتاجية تزيد عن 20 milligrams من البروتين المُنقى بتركيزات تتراوح بين 10 و 20 milligrams per milliliter. قسّم البروتين إلى حصص حجم كل منها 200 microliter، ثم جمدها عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.

لتحرير A ICD من GST، أضف 20 µL من الثرومبين بتركيز 1 unit/µL إلى 200 µL من G-S-T-A-I-C-D المنقى، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند 37 °C. وفي اليوم التالي، قم بإزالة أي مواد متكتلة عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند 4 °C. انقل السائل الطافي إلى أنبوب دقيق مبرد مسبقاً لإزالة GST والثرومبين. أضف 50 µL من glutathione aro slurry بتركيز 50% و 50 µL من p and wino zaine aro slurry بتركيز 50% على التوالي.

يُحضن المزيج مع التدوير لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يُجرى الطرد المركزي لفترة وجيزة لترسيب حبيبات agro beads، ثم تُنقل السوائل الطافية إلى أنبوب جديد. يتم استخلاص GST أربع مرات إضافية باستخدام الجلوتاثيون.

أجرى Aros مقايسة لتقدير كمية البروتين في 5 µL من A ICD المُنقى. وتتراوح العوائد النموذجية من مزرعة بحجم 400 mL بين 50 إلى 100 µg بتركيز يتراوح من 0.2 إلى 0.5 mg/mL. وبعد تخفيف A ICD المُحضّر حديثاً في PBS إلى تركيز 0.1 mg/mL، تم تحفيز التجمع الحراري عن طريق تحضين العينات عند درجة حرارة 43 °C وبسرعة 800 RPM في هزاز مُسخن لمدة 48 ساعة.

قم بتخفيف العينة بمقدار 20 ضعفاً باستخدام الماء منزوع الأيونات، وضع ميكرولترين منها على ميكا مقشورة حديثاً. جفف العينة في مجفف ليلة كاملة لتصور تجمعات A ICD. استخدم مجهر القوة الذرية في وضع النقر باستخدام كوابل نتريد السيليكون ذات طلاء ذهبي وبنصف قطر طرف اسمي يبلغ 2 نانومتر.

سعات النقر النموذجية أثناء التصوير هي 10 إلى 20 nanometers عند تردد الرنين للعوارض. يظهر هنا التعبير والإثراء النسبي لـ G-S-T-A-I-C-D. بعد التحلل، يتواجد معظم البروتين الاندماجي في الجزء القابل للذوبان، وبالتالي لا يلزم الاستخلاص من الأجسام الاشتمالية.

كانت المادة المستخلصة من عمود الجلوتاثيون نقية بنسبة تزيد عن 95%. وفي التحضير الموضح هنا، كان تركيز البروتين المستخلص من العمود 14.5 milligrams per milliliter، وكانت الحصيلة 22 milligrams. وقد أدى تحلل 200 microliters من هذا التحضير طوال الليل باستخدام 20 units من الثرومبين إلى تحلل البروتين الاندماجي بنسبة تقارب 100%.

تعتبر كمية الثرومبين المستخدمة منخفضة لدرجة أنها غير قابلة للكشف بواسطة صبغة كوماسي. وقد أدى التلوين باللون الأزرق وإزالة الثرومبين و GST إلى فقدان بعض المادة. ومع ذلك، كانت درجة النقاء أعلى من 90%، مع الحصول على مردود في هذه التحضيرة قدره 70 micrograms من A ICD بتركيز 0.35 milligrams per milliliter.

تكون تجمعات ICD، التي تم تصويرها بواسطة FM، عادةً غير متبلورة الستيرويد ويتراوح حجمها من 50 إلى 100 nanometers. ولا يمكن اكتشاف المواد المتجمعة عند إضافة كمية متساوية المولات من البروتين المرافق UBI Quillin one إلى تفاعل التجميع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تنقية EICD وتحفيز تجمعه وتصوير التجمعات بواسطة A-F-M-E-I-C-D.

يمكن تطبيق المواد التي تم تنقيتها بهذه التقنية في طرق أخرى مثل مقاييس تشتت الضوء ومصائد الترشيح للإجابة عن تساؤلات تتعلق بتأثير المرافقات الجزيئية على تجمع EACD.