غيروي ثلاثي الأبعاد

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في إنشاء نماذج نمطية ثلاثية الأبعاد لتطور سرطان المبيض في مراحله المبكرة. أولاً، يتم إنتاج خطوط خلوية مخلدة H turt مشتقة من أنسجة ظهارية وليفية مبيضية طبيعية وأولية. ثم، ولإعادة تهيئة البنية الموجودة داخل الجسم والتفاعلات الخلوية المعقدة الموجودة في المبيض، يتم إجراء استزراع مشترك لخطوط الخلايا الظهارية والخلايا السدوية في نماذج كروية S ثلاثية الأبعاد، ثم يتم تثبيت واستصباغ مستنبتات العضوانيات وتحليل تعبير علامات محددة من أجل دراسة السمات الجزيئية للتفاعلات بين الخلايا السدوية والظهارية.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها كيف يمكن للتغيرات في جزء الخلايا السدوية في النماذج النمطية ثلاثية الأبعاد أن تؤثر على النمط الظاهري للخلايا الظهارية المستزرعةร่วมًا. يمكن للنماذج النمطية ثلاثية الأبعاد أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث سرطان المبيض، مثل استكشاف أصول هذا المرض وتوضيح دور البيئة المجهرية السدوية في بدء الورم وتطوره. وتمتد تطبيقات هذه التقنيات نحو تشخيص المرض وعلاجه مقارنة بطرق الاستزراع ثلاثية الأبعاد الأخرى.

يمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق أوسع من أحجام المزارع الخلوية والتطبيقات اللاحقة. على سبيل المثال، يمكن استخدام المزارع ثلاثية الأبعاد المتجانسة والنمطية لاختبار الأدوية في المختبر. كما يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة نماذج أخرى، كما هو الحال في دراسة أنواع أخرى من الأورام الصلبة أو في الأمراض الحميدة.

انقل نسيج المبيض الطازج إلى مختبر زراعة الخلايا في وسط نمو الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية المخلدة والمكمل بمضادات حيوية ومضادات فطريات إضافية. اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام 5 mL من PBS لإزالة أي خلايا طلائية لا تزال مرتبطة بشكل فضفاض بالنسيج. بعد ذلك، انقل العينة مع PBS إلى طبق زراعة P 100 نظيف. وباستخدام أدوات معقمة، انقل النسيج إلى طبق زراعة P 100 نظيف وجاف ثانٍ.

قطع النسيج إلى قطع بمساحة 0.5 سنتيمتر مربع وانقل كل قطعة إلى طبق P 100 منفصل. استمر في تقطيع النسيج إلى قطع يقل حجمها عن مليمتر مربع واحد. ثم أضف 20 milliliters من وسط INOF GM وقم بالزراعة. راقب نمو الخلايا باستخدام المجهر الطوري.

تأكد من التصاق الخلايا بالطبق خلال 24 ساعة. وراقب نمو الخلايا باستخدام مجهر تباين الأطوار. عادة ما تلتصق الخلايا بالطبق في غضون 24 ساعة. وبعد مرور أسبوع، قم بإزالة أي أنسجة غير ملتصقة عن طريق الشفط، وقم بتجديد الوسط الغذائي، ثم أعد تغذية المزارع مرتين أسبوعياً خلال فترة تتراوح من أسبوع إلى ثلاثة أسابيع عندما يصل حجم المستعمرات الخلوية إلى حوالي 500 microns.

اعزل المستعمرات باستخدام أدوات النقل (trips) وأقراص الاستنساخ المغلفة. ومن أجل التأكد من أن الخلايا ليفية بنسبة 100%، قم بزراعة عينة من الخط الخلوي على شرائح غطاء زجاجية، وأجرِ صبغاً مناعياً فلورياً لكل من مؤشر خلوي ليفي، ومؤشر ظهاري، ومؤشر للخلايا البطانية.

قبل يوم واحد من عملية ترانسدكشن الفيروسات الرجعية لـ H Turt passage، يتم عزل الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية من طبق P 100 واحد وتوزيعها على ثلاثة أطباق P 100. يمكن شراء السائل الطافي الفيروسي المُعد مسبقاً أو إنتاجه داخلياً باستخدام البروتوكولات القياسية للترانسفكشن المشترك لخلايا HEC 2 9 3 T. لتحضير محلول poly Hema، قم بوزن 1.5 grams من poly hema، ووضعه في زجاجة معقمة.

أضف 95 milliliters من الإيثانول المطلق بدرجة نقاء البيولوجيا الجزيئية، وخمسة milliliters من الماء المقطر بدرجة نقاء زراعة الخلايا. ضع محلول poly Hema في حمام مائي عند 65 degrees Celsius حتى يذوب تماماً. قم بطلاء أطباق زراعة الأنسجة بمحلول poly Hema المحضر حديثاً.

اترك أطباق زراعة الخلايا لتجف في الهواء داخل غطاء التدفق الصفائحي. ويمكن استخدام الهز اللطيف على منصة هزازة لضمان التوزيع المتساوي للطلاء في الأطباق أو الدوارق ذات الحجم الأكبر. وإذا جف محلول polyus بسرعة كبيرة، فلن يكون السطح أملس.

إذا لزم الأمر، قم بمعالجة الخلايا الليفية مسبقاً قبل الزراعة ثلاثية الأبعاد، على سبيل المثال، لتحفيز الشيخوخة الخلوية، عالج الخلايا بجرعات دون مميتة من hydrogen peroxide. قم باستعادة وتوسيع مزارع خلايا INOF والخلايا الطلائية في المختبر لتوفير عدد كافٍ من الخلايا لإنشاء بنيات ستيروئيدية غير متجانسة الموضع ثلاثية الأبعاد. بعد غسل الخلايا بـ PBS لمدة خمس دقائق، أضف 15 milliliters من الوسط الغذائي إلى طبق poly hema.

وفي هذه الأثناء، أضف التربسين إلى خلايا الأرومة الليفية المبيضية الطبيعية المخلدة لفصلها عن طبق الزرع. وبعد مرور ثلاث إلى خمس دقائق، قم بتعادل التربسين بإضافة حجم مساوٍ من وسط الزرع، ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق كتلة الخلايا في 5 mL من الوسط واخلطها جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة أو باستخدام جهاز الرج vortex بلطف.

ثم استخدم عينة بحجم 10 µL لتعداد الخلايا الحية باستخدام صبغة tripan blue. الآن، أضف 4 مليون من خلايا INOF إلى الوسط الموزع مسبقاً في الطبق المغطى بـ poly hema. أكمل حجم وسط الزرع إلى 20 mL واحضنها عند 37 °C، و5% carbon dioxide.

راقب التجمع الخلوي إلى كرويات ستيرويدية متعددة الخلايا باستخدام المجهر الطوري لإعادة تغذية مزارع الكرويات كل يومين إلى ثلاثة أيام. ضع الأطباق بزاوية مائلة مستندة إلى ماصة. اترك الكرويات تترسب، ثم قم بإزالة حوالي 16 milliliters من الوسط المستنزف بعناية باستخدام ماصة سعة five milliliters.

أضف 16 milliliters من الوسط الغذائي الطازج إلى المزرعة وأعدها إلى الحاضنة في اليوم السابع. قم بإنشاء مزارع غير متجانسة النوع عن طريق إضافة الخلايا الظهارية إلى الخلايا الليفية phe. أولاً، قم بتحضير معلقات من الخلايا الظهارية المبيضية باستخدام التربسين كما تم وصفه سابقاً بعد تعداد الخلايا.

اغسل مرة واحدة في وسط INOF GM لمنع انتقال أي من عوامل النمو من أوساط نمو الخلايا الظهارية. بعد تجديد وسط مزارع OID الخاصة بالأرومات الليفية، أضف الخلايا الظهارية بنسبة أربعة إلى واحد من الأرومات الليفية إلى الخلايا الظهارية في المزرعة. يتم تغذية مزارع OIDs غير المتجانسة في وسط INOF GM بشكل نموذجي كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة 14 يوماً إضافية.

بالنسبة للكيمياء النسيجية المناعية، يتم تثبيت PHE باستخدام الفورمالين المنظم متعادل الرقم الهيدروجيني، ثم تجميع PHE في صورة كريات واستبدال الفورمالين بـ 70% ethanol. استمر في المعالجة لدمجه في البارافين باستخدام البروتوكولات القياسية المستخدمة للأنسجة البشرية. يمكن تقطيع الستيرويدات المدمجة في البارافين وصبغها بـ h and e أو بعلامات جزيئية محددة باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية.

وبدلاً من ذلك، يتم غسل الستيرويدات في PBS وتثبيتها في 4%para formaldehyde. ثم تُطمر العينات في وسط OCT وتُجمّد سريعاً من أجل التقطيع بالمجهر المبرد (cryostat) والتلوين المناعي الفلوري للتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي. تُغسل الستيرويدات في PBS ويتم تفكيكها بواسطة الهضم بالتريبسين أو Accutane عند 37 درجة مئوية.

يمكن تعزيز التفكك الكامل للستيرويدات إلى معلق خلوي أحادي عن طريق سحب المحلول ودفعه للأعلى والأسفل باستخدام رأس ماصة سعة 1 mL. يجب توخي الحذر لتجنب إجهاد الخلايا. يتم تحييد التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من وسط الزرع، ثم إزالة التكتلات الخلوية بتمرير المعلق عبر مصفاة خلايا بحجم 40 إلى 70 micron. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا في كرات (pellet) وغسلها بـ PBS وتعدادها، ثم إعادة تعليق العدد المطلوب من الخلايا في facts buffer وصبغها وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. في مختبرنا، قمنا بتحويل خلايا ظهارية مبيضية جزئياً، وزرعنا هذه الخلايا بشكل مشترك مع خلايا ليفية مبيضية طبيعية وهرمة لمحاكاة مراحل التطور المبكرة لسرطان المبيض.

في مبيض ما قبل سن اليأس، أظهر تلوين التألق المناعي للأرومات الليفية المبيضية الطبيعية الخالدة (h hert) أن كلاً من الأرومات الليفية المبيضية الطبيعية الأولية والأرومات الليفية المبيضية الطبيعية الخالدة قد عبّرت عن البروتين النوعي للأرومات الليفية، لكنها لم تعبّر عن السيتوكيراتين سبعة (cytokeratin seven) بينما عبّرت عن المينتون (menton). وتظهر خلايا الأرومات الليفية المبيضية الطبيعية التي زُرعت بمفردها في شكل ثلاثي الأبعاد (3D form PHE) مورفولوجيا مغزلية ومصفوفة خارج خلوية وفيرة. هنا، تم تعريض الأرومات الليفية المبيضية الطبيعية لبيروكسيد الهيدروجين لتحفيز الشيخخة على مدار سبعة أيام، ثم زُرعت مع خلايا ظهارية مبيضية متحولة جزئياً لمدة 14 يوماً.

للتمييز بين نوعي الخلايا، تم صبغ الستيرويدات الناتجة مناعيًا باستخدام mim one كعلامة على التكاثر وpan cytokeratin كعلامة ظهارية. يشير التقييم الكمي للبيانات إلى أن البيئة الدقيقة المتقدمة في السن تعزز السمات الورمية للخلايا الظهارية المتحولة جزئيًا، بينما تثبط البيئة الدقيقة الطبيعية التطور الورمي، ويتم استعادة السمات النسيجية للخلايا الطبيعية والخبيثة التي لا يمكن اكتشافها عند زراعة الخلايا في طبقات أحادية. فعند نقل الخلايا إلى زراعة الكرويات، على سبيل المثال، يمكن اكتشاف السمات النسيجية لسرطانات المبيض ذات الخلايا الصافية في المزارع ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا سرطان المبيض ذات الخلايا الصافية، ولكن ليس في المزارع أحادية الطبقة لنفس الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مزارع نموذجية ثلاثية الأبعاد لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية والخلايا السدوية خلال المراحل المبكرة من تكون الورم. عند إعداد مزرعة ثلاثية الأبعاد، من المهم ضبط أعداد الخلايا وفقاً للتطبيق اللاحق، مع مراعاة احتمال فقدان بعض المواد أثناء المعالجة.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إعداد المزارع ثلاثية الأبعاد في غضون ساعة واحدة باتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي مقترناً بتوصيف المصفوفات الدقيقة للتعبير الجيني لتحليل التغيرات الشاملة في التعبير الجيني التي تحدث في المزارع النموذجية ثلاثية الأبعاد ولكن لا يتم اكتشافها في ظروف المزارع أحادية الطبقة. وسيتيح ذلك تحليل مسارات الإشارات ثنائية الاتجاه التي تحدث تحديداً في البيئة الدقيقة للمزارع الأساسية ثلاثية الأبعاد.