نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نماذج استزراع مشترك ثلاثية الأبعاد تسمى هندسة بنية وبيئة الثدي الدقيقة، أو MAM، لاستخدامها في تصوير الخلايا الحية للتفاعلات بين الخلايا في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء شرائح الغطاء أولاً بكولاجين 1 مُخمد بفلورة D، أو DQ collagen one. مصفوفة كولاجين 1.

بعد ذلك، يتم إخماد الكولاجين من النوع الرابع (DQ collagen four). ثم تُضاف مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تكوينها فوق طبقة كولاجين DQ four المتصلبة، وهي مصفوفة كولاجين من النوع الأول تحتوي على أرومات ليفية مدمجة. وفي الخطوة الثالثة، يتم وضع معلق من الخلايا الظهارية أو الخلايا الورمية في طبقة فوق شرائح التغطية، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بكولاجين DQ four ومصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تكوينها، ثم يُضاف الوسط الزرعي.

وأخيراً، يُستخدم المجهر البؤري (confocal microscopy) لإجراء التصوير رباعي الأبعاد (4D imaging)، والذي يعمل على تحليل الصور في ثلاثة أبعاد مكانية، بالإضافة إلى عامل الزمن للمزارع المشتركة الحية من الخلايا الثديية. وفي نهاية المطاف، يتيح التصوير رباعي الأبعاد تصور وتحليل التفاعل الديناميكي بين خلايا أورام الثدي والخلايا الأخرى في البيئة الدقيقة للورم والتي قد تؤثر على تطور النمط الظاهري الغازي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التصوير الحي داخل الجسم (intravital imaging)، في أن التفاعلات التي يتم رصدها في نموذجنا هي بين خلايا من نوع واحد، وهي خلايا الورم البشرية والخلايا البشرية المرتبطة بالورم، بدلاً من أن تكون، على سبيل المثال، بين خلايا ورم بشرية وخلايا سدوية فأرية.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تجميع المزارع الأساسية الرئيسية يتطلب أولاً تصوراً دقيقاً، ثم يتطلب مهارات متوسطة وممارسة لتحقيق النجاح. ابدأ بوضع غطاء بلاستيكي مستطيل معقم بالكحول. أدخله في طبق زراعة بمقاس 35 مليمتر أو استخدم طبق mu بمقاس 35 مليمتر من IBI tree.

بعد ذلك، امزج العدد المطلوب من الخلايا الليفية (fibroblasts) مع كولاجين DQ. ثم، باستخدام ماصة دقيقة سعة 100 µL، اسحب بعناية ووزع 70 µL من مزيج الخلايا الليفية وكولاجين DQ، مصفوفة كولاجين واحدة، فوق السطح الكامل للشريحة الغطائية، وضع طبق الزرع في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. وبعد أن تتصلب المصفوفات، اتركها لتتوازن لمدة 10 دقائق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide.

بعد ذلك، ضع الطبق تحت غطاء سحب الهواء حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 60 µL من DQ collagen، وfour reconstituted basement membrane matrix فوق DQ collagen المتصلب، ثم collagen one matrix الذي يحتوي على الخلايا الليفية المدمجة. وباستخدام رأس الماصة، قم بتوزيع DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix بعناية وبشكل متساوٍ، مع تجنب خدش الخلايا الليفية في DQ collagen one, collagen one matrix.

بعد ذلك، انقل الطبق وغطاء الشريحة إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide لمدة 10 دقائق، وبينما تتصلب مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها DQ collagen four، قم بهضم الخلايا باستخدام trypsin وعد الخلايا المخصصة للاستزراع المشترك. الآن، ضع 50 microliters من معلق الخلايا فوق غطاء الشريحة المطلي، وضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 40 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بـ DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix. وبعد التصاق الخلايا بالمصفوفة، أضف 2 milliliters من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 2% reconstituted basement membrane إلى الطبق مقاس 35 millimeter.

ثم يتم التحضين للفترة الزمنية المطلوبة قبل التصوير؛ فبعد الغسيل باستخدام PBS، تُحضن المزارع المشتركة مع 5 µM من cell tracker orange في وسط MEGM داخل حضانة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide لمدة 45 دقيقة. بعد انتهاء التحضين، تُغسل المزارع المشتركة بـ PBS مرة أخرى وتُحضن في وسط MEGM مُدفأ مسبقاً لمدة 30 دقيقة في حضانة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide. يتم تصوير المزارع المشتركة الحية بتكبير منخفض، على سبيل المثال، عند 10x باستخدام عدسة غمر مائية (water dipping lens) على مجهر كونفوكال، مع التقاط مقاطع بصرية على فترات 10 micron عبر كامل عمق الهياكل.

استخدم المقاطع البصرية لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج velocity أو برنامج مماثل. قم بإنشاء مقاطع فيديو لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بحيث يمكن تصور البنى، والتفاعلات بين الخلايا، والتفاعلات مع المصفوفة المحيطة. في هذا المخطط التوضيحي النموذجي لمزرعة مشتركة، تم طلاء طبق IBI treat أولاً بالكولاجين، أحدهما يحتوي على DQ collagen، والآخر يحتوي على الخلايا الليفية (fibroblasts) كما يظهر هنا باللون الأرجواني.

ثم أُضيفت طبقة ثانية من الغشاء القاعدي المعاد تشكيله الذي يحتوي على DQ collagen four. بعد ذلك، تم زرع الخلايا الورمية باللون الأحمر في الأعلى فوق 2% من الغشاء القاعدي المعاد تشكيله في المزرعة.

تم وضع الوسط الغذائي الممثل بالنقاط ذات اللون الكريمي فوق كل تغيير في الوسط. وتظهر نواتج الانقسام الفلورية لـ DQ collagen one و DQ collagen four باللون الأخضر. وعلى مدار 23 يوماً من هذا المزار المشترك النموذجي لـ MCF 10 DCIS و WS 12 TI، لوحظ تكاثر الخلايا المصورة هنا وفي الأشكال التالية (باللون الأحمر)، بالإضافة إلى تحلل DQ collagen four و DQ collagen one الملاحظ هنا وفي الأشكال التالية (باللون الأخضر)، وكذلك تحلل مصفوفات الكولاجين كما يتضح من انخفاض حجم المزارات المشتركة.

تمت ملاحظة المزارع المشتركة الحية ذاتها على مدار 23 يوماً، مع التقاط صور بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy) في الأيام الثالث والثالث عشر والثالث والعشرين من الزراعة المشتركة. إن التفاعلات في المزارع المشتركة من الخلايا الظهارية والخلايا المتوسطة (Mame) ديناميكية ويمكن أن تتغير بمرور الوقت. فعلى سبيل المثال، كما يظهر في هذا النموذج ثلاثي الأبعاد للمزرعة المشتركة (mam) في اليوم الثالث، بدأت الخلايا للتو في التكاثر داخل المصفوفات في هذه المرحلة الزمنية، ولا تزال مستقرة تماماً كما يتضح من غياب الفلورة الخضراء.

ومع ذلك، وبحلول اليوم 16، ومع استمرار تكاثر الخلايا، بدأت هذه الخلايا أيضاً في تحليل بنية المصفوفة، كما يظهر هنا من خلال نواتج انقسام الكولاجين DQ واحد وأربعة باللون الأخضر، والتحلل النشط للمصفوفة بواسطة الخلايا حيث تظهر المصفوفة والخلايا بفلورة مشتركة باللون الأصفر. وبحلول اليوم 23، تم تحليل ما يقرب من نصف المصفوفة بواسطة الخلايا سريعة التكاثر مقارنة باليوم الثالث عندما كان حجم المزرعة المشتركة 110,000 cubic micrometers. وبين اليوم 16 و 23، انخفض الحجم إلى 46,250 cubic micrometers فقط في هذا اليوم.

في المزارع المشتركة، يمكن ملاحظة تحلل بروتين كولاجين DQ رقم 4 عند سطح خلايا DCIS الملونة باللون الأحمر، والتحلل المنتشر لكولاجين DQ رقم 1 في المناطق القريبة من الخلايا الليفية الملونة باللون الأبيض. كما تسمح الصبغة التفاضلية المستخدمة في هذه المزارع المشتركة بمراقبة أنماط الهجرة والتكاثر المتميزة لنوعي الخلايا بعد تطورهما. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان الثدي لاستكشاف تأثيرات البيئة الكلية للورم على تطور السرطان، مع الاستفادة من التصوير الحي للخلايا لرصد التفاعلات الديناميكية بين الخلايا السرطانية وخلايا السدى المحيطة بها.