متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام نهج متعدد الأهداف للتحديد البنيوي لبروتين مستهدف عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية، بدءاً من جين واحد أو تسلسل جيني واحد في الحالة المعروضة هنا. البروتين المستهدف هو الوحدة الفرعية PB2 لإنزيم البوليميراز من إنفلونزا A، وهو مكون رئيسي في التضاعف الفيروسي. يتم تحقيق النهج متعدد الأهداف من خلال تصميم واستنساخ سلسلة من البناءات الجينية بالتوازي أولاً بناءً على التسلسل المستهدف الواحد والمعلومات الأخرى المعروفة عن البروتين.

تتمثل الخطوة الثانية في اختبار مستويات التعبير لكل بناء جيني واختيار أفضلها لإنتاج البروتين على نطاق واسع في المزارع الخلوية. وتتطلب الخطوة التالية تكسير الخلايا لاستخلاص البروتينات المستهدفة من مادة التعبير وتنقية كل منها للوصول إلى درجة نقاء عالية جداً. بعد ذلك، يتم إعداد سلسلة من تجارب البلورة لكل بروتين للحصول على شكل بلوري مناسب لدراسات الأشعة السينية.

يتم بعد ذلك جمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الدقة لبلورة واحدة أو أكثر، وتُستخدم لحل وتنقية خريطة الكثافة الإلكترونية التي تحدد بنية كل بروتين مستهدف. وتسمح هذه النتائج بتمثيل بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين المستهدف بناءً على خريطة الكثافة الإلكترونية. كما تزيد المعالجة متعددة الأهداف بشكل كبير من احتمالية النجاح في تحديد البنية من خلال توفير بدائل قابلة للتطبيق عند كل عقبة محتملة في المسار.

كما أن العمل على أهداف متعددة بالتوازي يتسم بكفاءة عالية، مما يقلل من الوقت والتكلفة لكل بروتين في كل خطوة. وسوف تتيح إمكانية زيادة معدل إكمال التحديد البنيوي للأهداف القابلة للعلاج المزيد من فرص تطوير العلاجات سنوياً. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى قيمة في البيولوجيا البنيوية، فإن البروتينات عالية الجودة التي يتم الحصول عليها من خلال هذه الطرق يمكن أن تدعم أي بحث قائم على البروتينات.

تتميز كل مرحلة من مراحل هذه العملية بعلمها الخاص وتتطلب خبرة محددة، ولكن الاستثمار في الكوادر والأجهزة والمعرفة التقنية يمكن أن يؤتي ثماراً ممتازة بمجرد تجميع كافة العناصر. وبمجرد اختيار الجين المستهدف وناتج الجين للفحص، تتطلب الخطوة الأولى تصميم متغيرات أو تركيبات جينية متعددة. ويُستخدم برنامج Gene composer لتصميم هذه التركيبات على مستوى البروتين مع الكود المرتبط بها في تسلسلات الجينات الاصطناعية المهندسة.

باستخدام وحدة عرض المحاذاة ووحدة تصميم البروتين، قارن محاذات تسلسلات البروتين وحدد تصميمات بناء البروتين لبوادئ PCR للمدرج (insert PCR) وبوادئ PCR للناقل (vector PCR) أو النهايات. بعد ذلك، استخدم خوارزمية "البروتين إلى DNA" في برنامج gene composer لترجمة كل تسلسل أحماض أمينية عكسياً إلى تسلسل حمض نووي مصمم هندسياً. استخدم جدول استخدام الكودونات المناسب لتحسين التسلسل من أجل التعبير في خط خلوي محدد.

في هذه الحالة، بكتيريا e coli. بمجرد تجهيز تسلسل الجين المستهدف، يتم استنساخه افتراضياً وإدخاله في بلازميد ناقل مناسب للتعبير البكتيري. في هذه الحالة، ناقل PET 28 معدل.

يحتوي هذا الناقل على مكونات معينة ضرورية للتعبير وتنقية البروتين. يتم تعديل الجين المستهدف لدمج تسلسل وسم الهيستيدين عند الطرف N أو C للبروتين، بالإضافة إلى تسلسل قطع للسماح بإزالة الوسم أثناء عملية التنقية. كما يمتلك الناقل جيناً لمقاومة المضادات الحيوية لاختبار التعبير وعملية التخمير.

يتم بعد ذلك إنشاء التسلسل الجيني لكل بروتين مستهدف باستخدام طرق تصنيع الجينات القياسية تحضيراً لاستنساخ التمديد الأولي غير المكتمل لبوليميراز الاستنساخ (pipe cloning)، وهو استراتيجية استنساخ تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) حيث يتم تضخيم الجين المستهدف باستخدام بادئات مكملة للناقل المقصود. وتستغل هذه الطريقة الطبيعة غير المكتملة للمراحل المتأخرة من تفاعل PCR، والتي تترك نواتج التفاعل بنهايات متغيرة أحادية السلسلة. أقوم بتحضير تفاعل PCR للمدرج أو IPCR عن طريق إضافة 5 µL من كل من البادئات الأمامية والعكسية إلى كل تفاعل.

في لوحة ذات 96 بئراً ووفقاً لمخطط اللوحة، أضف 2 µL من كل جين اصطناعي كامل الطول إلى البئر المناسب حسب مخطط اللوحة. بعد إضافة 25 µL من المزيج الرئيسي PFU إلى كل بئر، قم بتدوير التفاعلات 25 مرة باستخدام ظروف PCR التالية: المسخ عند 95 °C لمدة 30 ثانية.

يتم التسخين عند 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، ثم التمديد عند 68 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ويتم التأكد من تضخيم القطع عن طريق تحليل هلام AGROS لمنتجات IPCR. وتتمثل منتجات IPCR الناجحة في ظهور حزم قوية.

غالبًا ما تظهر النتائج غير المرغوب فيها على شكل حزم باهتة أو لطخات في تفاعل منفصل. يتم تضخيم بلازميد التعبير عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للناقل (vector PCR)، أو يتم تأكيد تضخيم قطعة VPCR من خلال تحليل هلام AROS لمنتجات VPCR. وبمجرد تضخيم منتجات IPCR و VPCR، تُضاف إلى طبق الدمج وتوضع في جهاز الدورات الحرارية لإجراء تفاعل الدمج.

بعد ذلك، يتم تحويل البناءات التي تم استنساخها بنجاح إلى خلايا e coli كيميائياً كفؤة، وتُحفظ في مخزونات الجلسرين لبدء اختبار التعبير عن طريق التخطيط. يتم تخطيط كمية صغيرة من كل عينة من مخزون الجلسرين للبناء المستنسخ على طبق أغار منفصل. يُحضّر الطبق باستخدام مرق مغذٍ بكتيري مع إضافة المضاد الحيوي Kanamycin المشفر في الناقل، ثم يُحضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي.

ابدأ باستزراع أولي لكل عينة عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من طبق آغار حديث النمو. استخدم هذه المستعمرة لتلقيح 1.2 milliliters من مرق TB المكمل بـ can mycin والجلوكوز للمعالجة المتوازية. يتم تنمية كل مستزرع أولي في كتلة ذات قاع مستدير مكونة من 96 بئراً.

يتم الإنبات طوال الليل عند 37 °C مع الرج بسرعة 220 دورة في الدقيقة. بعد الإنبات الليلي، ابدأ مزارع تحفيز صغيرة الحجم لكل عينة باستخدام 40 µL من المزرعة المسبقة للتلقيح.

1.2 ملليلتر من مرق TB. مضاف إليه 50 مليجرام لكل ملليلتر من الكاناميسين ونظام novagen overnight express. أولاً، يتم تنمية مزارع الحث عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، مع الرج بسرعة 220 RPM، ثم تُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4,000 GForce لمدة 15 دقيقة.

قم بسكب السائل الطافي وتخزين الرواسب عند درجة حرارة -20 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل المتابعة في المعالجة بعد التنقية. قم بتحليل البروتين مع وبدون تفاعل الانشطار عن طريق الفصل الكهربائي الشعري باستخدام نظام caliper lab CHIP 90 وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. في حالة بروتين influenza a PB two، أدت 14 من أصل 34 بنية إلى بروتين مستهدف قابل للذوبان، وانتقلت إلى الخطوة التالية وهي التخمير واسع النطاق.

لبدء عملية تخمير واسعة النطاق، يتم تلقيح 100 ملليلتر من مرق مستنبت الخلايا البكتيرية الذي يحتوي على 50 مليغرام لكل ملليلتر من Canmycin من مخزون الغليسيرول، وتُترك للنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 220 RPM. وفي اليوم التالي، يتم توسيع المزرعة الأولية باستخدام 10 ملليلتر للتلقيح.

ضع لترًا واحدًا من المرق الذي يحتوي على وسط التحريض التلقائي و 50 mg/mL من الكاناميسين في دورق مخروطي بسدادات سعة لترين. قم برج المزارع المتوسعة عند 37 °C كل 30 دقيقة تقريبًا. تحقق من الكثافة الضوئية للمزرعة عن طريق قياس الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي قدره 600 nm.

عندما تصل الكثافة الضوئية إلى 0.6، قم بتغيير درجة حرارة الحاضنة الهزازة إلى 20 درجة Celsius بعد وقت النمو المطلوب. اسحب عينة ممثلة بحجم 10 milliliter من كل بناء لاختبار التعبير. قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 GForce units لمدة 15 دقيقة.

صَفِّ السائل الطافي وجَمِّد رُسابة الخلايا عند درجة حرارة 80- °C. لبدء هذا الإجراء، قم بإذابة عجينة الخلايا وإعادة تعليقها في محلول التحلل بنسبة حجم إجمالي تبلغ 1 إلى 5. حرك المزيج بقوة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

استخدم ملعقة مخبرية نظيفة لتفكيك الكتل الملتصقة بجدار الكأس. قم بتحليل الخلايا ميكانيكيًا على الثلج باستخدام جهاز سونيكاتور. قم بتصفية المستخلص الخام عن طريق الطرد المركزي عند 18,000 GForce لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

اجمع السائل الطافي واحفظ جزءاً صغيراً منه للتحليل قبل البدء في عملية التنقية واسعة النطاق. تحقق من التعبير البروتيني واسع النطاق لكل مزرعة عبر تحليل هلام SDS page. تُظهر نتيجة SDS page النموذجية هذه تعبيراً بروتينياً قوياً، وبدرجة ذوبان تصل إلى 50% تقريباً، وانقسام بنسبة 50% تقريباً.

في هذه الحالة، تمت إزالة علامة الهيستيدين بالإضافة إلى علامة ذوبان البروتين المضافة، والتي تم تصميمها هندسياً في البنية الأصلية. ويُستخدم راتنج النيكل لفصل البروتين المستهدف الذي يحمل علامة الهيستامين الفريدة عن جميع المواد الخلوية الأخرى، بما في ذلك البروتينات البكتيرية الأصلية. يتم تحضير عمود النيكل عن طريق الغسل بأربعة أحجام من العمود من مياه UE لإزالة محلول التخزين، يليه حجم واحد من العمود من المحلول المنظم B وخمسة أحجام من العمود من المحلول المنظم.

يتم إجراء موازنة متوازية لـ A for E باستخدام جهاز تحضير البروتين، القادر على تشغيل أعمدة متعددة في وقت واحد. قم بتحميل كل مستخلص مصفى يحتوي على بروتين ذائب يحمل علامة الهيستيدين في عمود منفصل بمعدل 2 mL في الدقيقة، متبوعاً بغسلات متعددة بحجم العمود باستخدام المنظم A، ثم اجمع المنظم المتدفق واحفظه للتحليل. استخلص البروتين المرتبط في سلسلة من التدرجات الخطوية باستخدام المنظمين A و B بنسب 95 إلى 5، ثم 60 إلى 40، وأخيراً 100% من المنظم B. تتنافس المكونات الموجودة في المنظم B مع الهيستيدين على راتنج النيكل، وبالتالي تعمل على إزالة البروتين من العمود بنسبة معينة.

اجمع كل جزء من أجزاء الشطف بشكل منفصل. تظهر هنا نتيجة كروماتوجرام ممثلة لعملية تشغيل على عمود النيكل one. قم بتحليل أجزاء الشطف من عمود النيكل one، والتحلل الخام، والتحلل المصفى، والتدفق النافذ من عمود النيكل one باستخدام تقنية SDS page وقارن النتائج مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 nanometers الذي تم جمعه أثناء تنقية العمود.

تحدد هذه الخطوة ما إذا كانت عملية التنقية قد نجحت. قم باختيار ودمج الكسور التي تحتوي على البروتين المستهدف لمتابعة المعالجة الإضافية. احسب الكمية الإجمالية للبروتين في هذه المرحلة باستخدام معامل الخمود النظري للبروتين، وذلك عن طريق قياس الامتصاص فوق البنفسجي عند 280 nanometers مع مراعاة الحجم الإجمالي للكسور المدمجة.

احفظ عينة صغيرة للتحليل. لقد تم تشفير جين البروتين المستهدف بتسلسل محدد، والذي يتعرف عليه ULP one كموقع قطع، وبالتالي فإن إضافة ULP one تؤدي إلى القطع بين علامة الهيستيدين والبروتين المراد دراسته. لبدء هذا الإجراء، أضف 1 µL من ubiquitin like protease, one لكل 5 mg من البروتين الموجود في الكسور المجمعة.

في هذه المرحلة، يُنقل البروتين المشطور من المنظم B إلى المنظم A لمزيد من المعالجة باستخدام أنابيب الديلزة، حيث يتم إجراء ديلزة للبروتين مقابل لترين من المنظم A لمدة أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب. استخدم حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10 kilodalton لـ PB two بعد الديلزة. قم بتشغيل هلام SDS page آخر للبروتين المستهدف في وجود وغياب ULP one.

سيحدد هذا ما إذا كان قطع ULP one قد تم بنجاح، وسيتيح اختيار أفضل الكسور للمتابعة في عمليات المعالجة اللاحقة. تظهر هنا نتائج SDS page نموذجية لثلاثة تركيبات من البوليميراز pb. يوجد مؤشران للوزن الجزيئي للوحدات الفرعية في الحارة الأولى.

تُمثل المسارات الثاني والسادس والعاشر بروتينات مجمعة من أعمدة النيكل الأولى. وتحتوي المسارات الثالث والسابع والحادي عشر على التدفق النافذ للبروتين المقطوع في المنظم A من النيكل الثاني، بينما تُظهر المسارات الرابع والثامن والثاني عشر إزالة علامة الهيستامين في المنظم B من النيكل الثاني.

بعد إزالة الهيستامين، يتم تركيز الكسور المجمعة من عمود النيكل الثاني. لبدء عملية الفصل الكروماتوغرافي باستبعاد الحجم (SEC)، يجب اختيار الراتنج المناسب مرة أخرى بناءً على الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف. في هذه الحالة، يتم استخدام عمود Superdex 75 10/30 GL وموازنته باستخدام 200 milliliters من منظم SEC بمعدل تدفق 0.5 milliliters في الدقيقة. باستخدام حقنة سعة خمسة milliliter، يتم تحميل العينة في حلقة عينة سعتها 10 milliliters وبدء تشغيل عمود SEC. يتم مراقبة مخطط كروماتوغرام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 nanometers أثناء جمع كسور ذات أحجام صغيرة.

قم بتشغيل جميع كسور SEC ذات الصلة عبر SDS page. تُجرى الطريقة القياسية لتجارب بلورة البروتين باستخدام طريقة القطرة الجالسة التي تتضمن الانتشار البخاري. ومن الشائع إعداد شاشتين أو أكثر من المصفوفات المتناثرة في البداية لكل بروتين مستهدف.

لبدء هذه العملية، قم بملء كل خزان في لوحة بلورة مدمجة جونيور ذات 96 بئراً بـ 80 µL من كل حالة في شاشة البلورة المختارة، ثم وزع 0.4 µL من البروتين في محلول SEC المنظم في كل بئر من الآبار الـ 96. بعد ذلك، أضف 0.4 µL من شاشة البلورة، مع ضمان الخلط الكامل للقطرة في كل بئر. قم بتغطية اللوحة بالكامل بشريط إغلاق شفاف، مع التأكد من إحكام الغلق على كل بئر، ثم خزن اللوحة عند 16 °C في مكان مستقر خالٍ من الاهتزازات البيئية.

افحص تبلور البروتين بشكل دوري على مدار الأسابيع القليلة القادمة تحت مجهر تشريحي. وفي حال عدم ظهور بلورات البروتين، قم بإعداد أطباق جديدة بظروف مختلفة وقم بتغيير تركيز البروتين في القطرة النهائية لزيادة احتمالية النجاح قبل الحصاد. قم بتبريد قرص من طراز A LS في وعاء مملوء بالنيتروجين السائل وغطه بغطاء لبدء عملية الحصاد.

اقطع الشريط الشفاف الذي يغطي البئر الذي يحتوي على بلورة البروتين المستهدفة وانقله إلى بئر فارغ مجاور. أضف 1.6 µL من محلول التبلور المقابل واخلطه مع 0.4 µL من ethylene glycol. يعمل محلول ethylene glycol بتركيز 20% في محلول التبلور على حماية بلورة البروتين.

خلال عملية التجميد العميق (cryo freezing)، قم بتحليل البلورة تحت المجهر واختر حلقة تجميد (cryo loop) مناسبة لعملية الحصاد، بحيث يتطابق القطر الداخلي للحلقة مع أقصى عرض للبلورة. قم بتثبيت حلقة التجميد على عصا بلورات مغناطيسية، ثم التقط البلورة مباشرة من محلول البئر. قم بغمس حلقة التجميد التي تحتوي على البلورة المحصودة فوراً في مادة واقية من التجمد، ثم اغمرها في قرص من طراز LS.

للتجميد السريع، كرر عملية تجميد البلورات للعدد المطلوب من البلورات. وبمجرد اكتمال عملية الحصاد، استخدم عصا الأقراص لوضع غطاء مغناطيسي على القرص الذي يحتوي على البلورات المجمدة سريعاً ذات الألسنة المنحنية. اقلب القرص رأساً على عقب للخطوة التالية.

قم بربط دافع القرص (puck pusher) في القرص، ثم انقل القرص إلى جهاز KU actor doer واستخدمه لخلع الغطاء. تظل البلورات الموجودة في القرص مجمدة في حمام من النيتروجين السائل حتى يحين وقت دراسات حيود الأشعة السينية باستخدام برنامج الحصول على الصور J Director. اضبط المعاملات التالية لفحص البلورات: شق الحزمة عند 0.5 degrees، ومسافة الكاشف 50 millimeters، وخطوة الصورة عند 70 degrees، ومدة التعرض 30 seconds.

تظهر هنا لقطة شاشة نموذجية من برنامج الحصول على الصور أثناء فحص بلورة ما؛ حيث تعرض اللوحة المركزية حيود الأشعة السينية المرصود من بلورة ممثلة، مع جمع صور كافية بدقة عالية للحصول على مجموعة بيانات كاملة مطلوبة لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد. وقد أدت استراتيجيات الاستنساخ وتنقية البروتين الموضحة في هذا الفيديو إلى الحصول على 14 عينة منقاة من PB two، نتج عن تسع منها بلورات مناسبة لدراسات الحيود. وقد تم جمع مجموعة بيانات حيود الأشعة السينية داخلياً لخمسة من التصاميم التسعة باستخدام إشعاع QK alpha، وذلك بواسطة مولد أشعة سينية ذو مصعد دوار من نوع rigaku super bright FRE plus، مجهز بـ ossec variax hf، وبصريات HF، وكاشف CCD من نوع Saturn 944 plus.

تظهر هنا صورة حيود الأشعة السينية للوحدة الفرعية PB2 من إنزيم البوليميراز. تمت معالجة كل مجموعة بيانات وتحديد ما مجموعه أربعة هياكل للوحدة الفرعية PB2. خضع كل هيكل لمراجعة الأقران وتم رفعه إلى بنك بيانات البروتين لإتاحة الوصول إليه للعامة.

يوضح هذا الشكل مخططات شريطية للجزيئات في الوحدة غير المتماثلة للبلورة. ومن بين هياكل PB two الأربعة، تم تلوين البنى الثانوية بنمط قوس قزح مع رموز PDB المقابلة. ويظهر في هذا الجدول تحليل النتائج لأهداف influenza PB two باستخدام الطرق الموضحة في هذا المقال المرئي.

يتم توضيح مسار المعالجة المتوازية متعددة الأهداف لتحديد البنية من الجين في خمس خطوات: الاستنساخ، والذوبانية، والتنقية، والبلورة، وتحديد البنية. لا يوفر مخرج مسار البيولوجيا البنيوية لدينا الأساس للأبحاث القائمة على البنية فحسب، بل يغذي أيضًا دراسات إضافية مثل المقايسات الوظيفية لتأكيد وظيفة البروتين أو الفحص الفيزيائي الحيوي للمركبات الجديدة باستخدام MAR أو SPR لتحديد نقاط بداية جديدة لتطوير الأدوية. لقد ساعدت هذه التقنية والأدوات التي ابتُكرت معها في تمهيد الطريق لعلماء البيولوجيا البنيوية للكشف عن العديد من أنواع الاستقصاءات القائمة على الاكتشاف، بما في ذلك تصميم الأدوية القائم على البنية، والذي كان له تأثير كبير على صحة الإنسان والأمراض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مساهمة المعالجة المتوازية لعدة أهداف في زيادة نجاح التحديد البنيوي بشكل كبير. لا تنسَ أن العمل في مختبر البيولوجيا البنيوية قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات المناسبة، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE)، أثناء ممارسة الأنشطة المختبرية.