تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التكافل البكتيري المسمى فلوروسنتياً داخل العائل من الديدان الخيطية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم البكتيريا ببروتين فلوروسنتي من خلال الاقتران. وتتمثل الخطوة الثانية في عزل ديدان AIC الخيطية عن طريق حصاد البيوض.

بعد ذلك، يتم استزراع ديدان AIC الخيطية بالتزامن مع البكتيريا المتعايشة الملحقة بصبغة فلورية للسماح بالارتباط الطبيعي، وفي نهاية المطاف تحديد تموضع البكتيريا المتعايشة داخل العائل من الديدان الخيطية. ويمكن تحديد مدى تكرار هذا الارتباط ضمن مجتمع الديدان الخيطية عن طريق المجهر الفلوري. ومن شأن هذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التكافل، مثل: أين تتماوضع البكتيريا داخل عائلها، وكيف تتوزع حمولة البكتيريا عبر مجتمع العوائل؟

بعد نمو السلالات البكتيرية طوال الليل، قم بإجراء استنبات فرعي لسلالات المانح والمستقبل والمساعدة في أوساط نمو غنية بالمغذيات وخالية من المضادات الحيوية بنسبة 1 إلى 100 من المزرعة إلى الوسط، ثم قم بتنمية المزارع في درجة الحرارة المناسبة لكل سلالة حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط. بعد ذلك، ادمج السلالات في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد وقم بطرد المزارع المختلطة مركزياً لمدة دقيقتين عند 17,900 Gs، ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 30 µL من الوسط الطازج. بعد ذلك، ضع قطرة من المعلق على طبق وسط غني بالمغذيات بدون أي مضادات حيوية، واترك القطرة لتجف.

قم بتحضين الطبق مقلوباً طوال الليل في درجة حرارة تكون مثالية للبكتيريا المستقبلة ومسموح بها للمانحة والمساعدة إذا كان ذلك ينطبق. الآن، قم بكشط البقعة وتخطيطها للحصول على مستعمرات منفردة على طبق مضاد حيوي انتقائي للحصول على مزرعة نقية من تخطيط البكتيريا، ثم اختر مستعمرة واحدة للعزل. وأخيراً، تأكد من أن المستعمرات الناتجة هي المتعايشة المستقبلة وليست السلالة المانحة.

من خلال الفحص للكشف عن وجود أنماط ظاهرية محددة للمستقبل. على سبيل المثال، يمكن تمييز بكتيريا cino abdi عن بكتيريا e coli عن طريق إجراء اختبار الكاتاليز، ثم الفحص للكشف عن وجود البلازميد من خلال تأكيد الفلورة تحت الطول الموجي المقابل لبروتين البلازميد الفلوري. بعد زراعة المتعايش البكتيري الطبيعي طوال الليل، وزع 600 µL من المزرعة البكتيرية على 8 إلى 10 أطباق آغار دهنية بقطر 10 mm، ثم حضّن الأطباق في الظلام دون رطوبة عند 25 °C.

بعد مرور يومين، أضف 5, 000 من النيماتودا اليرقانية المعدية في 500 µL من الوسط الغذائي إلى المستعمرات البكتيرية. وبعد تحضين الأطباق عند 25 °C لمدة ثلاثة أيام أخرى، ضع 20 µL من الماء على شريحة مجهرية. ثم استخدم عوداً معقماً لكشط كمية صغيرة من النيماتودا من المستعمرة البكتيرية.

ضع العود في الماء للسماح للنيماتودا بالسباحة والخروج. افحص هذه الشريحة تحت تكبير منخفض. إذا كانت البيوض والإناث مرئية، فاستمر عندما تحتوي الإناث على بيوض، ثم ضع بضعة ملي لترات من الماء على سطح الأطباق، وحرك الأطباق بلطف ثم صب الماء في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

يجب أن تنفصل الخيوط الورمية (النيماتودا) عن الأطباق بحيث لا تعود مرئية على سطح الطبق. اترك النيماتودا تترسب في قاع الأنبوب، ثم اسحب الماء الزائد من أعلى الأنبوب باستخدام الماصة وأعد ملء الأنبوب بماء نظيف. بعد ترك النيماتودا البالغة تترسب وسحب الماء الزائد مرة أخرى، املأ الأنابيب المخروطية بمحلول البيض.

ثم اخلط الأنابيب عن طريق القلب اللطيف لمدة 10 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة. وبعد الرج، قم فوراً بطرد مركزي للأنابيب المخروطية لمدة 10 دقائق بالضبط عند 1, 250 Gs وفي درجة حرارة الغرفة مع تفعيل المكبح. ثم صب السائل الطافي بسرعة، وأعد تعليق الراسب باستخدام محلول البيض عن طريق السحب بالماصة، واملأ الأنبوب المخروطي بمحلول بيض جديد.

امزج معلق البيض جيداً عن طريق قلب الأنبوب من ثلاث إلى خمس مرات، ثم قم فوراً بترسيب البيض وسحب السائل الطافي كما هو موضح للتو. أعد تعليق الراسب في مرق misogyny أو مرق LB عن طريق السحب بالماصة، ثم انقل معلق البيض إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. الآن املأ الأنبوب سعة 15 ملليلتر بمرق LB، واغسل البيض ثلاث مرات في المرق باستخدام تقنية الخطوات السريعة ذاتها التي تم عرضها للتو، ثم خفف بيض نيماتودا P المعاد تعليقها ليصل التركيز إلى 10 بيضات على الأقل لكل 1 µL.

انقل البيوض إلى طبق بتري بقطر ستة سنتيمترات يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط LB ومضادات حيوية ضد البكتيريا المستعمرة. يمكن تخزين الطبق ملفوفاً بورق البيرفيل لمدة تصل إلى أربعة أيام بعد النمو طوال الليل واختيار البكتيريا الفلورية. استخدم عوداً معقماً لتوزيع 600 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية على أقراص دهنية بقطر 10 مليمتر، ثم قم بتحضين المزرعة عند 25 درجة مئوية.

بعد مرور يومين، قم بتوزيع من 500 إلى 5,000 بيضة نيماتودا على كل طبق دهني. إذا كان الطبق قد تم تخزينه، فاغسل البيض في 15 milliliters من LB كما تم توضيحه للتو مرة واحدة على الأقل قبل تلقيح البيض على المستعمرات البكتيرية التي تم تحضيرها مسبقاً. ثم قم بحضن المزارع المشتركة للنيماتودا والبكتيريا في الظلام بدون رطوبة عند 25 degrees Celsius حتى تظهر اليرقات المعدية كحلقة بيضاء زغبية على حافة الطبق.

عند ملاحظة اليرقات المعدية، قم بإزالة غطاء طبق الآجار الدهني وضع قاعدة الطبق في قاع طبق بتري فارغ مقاس 100 مليمتر في 20 مليمتر. ثم املأ طبق بتري بكمية كافية من الماء لتصل إلى حوالي نصف ارتفاع الطبق الأصغر، واحضن مصيدة المياه حتى تخرج اليرقات المعدية الناتجة إلى الماء.

بعد جمع النيماتودا من الماء أو في المرحلة العمرية المطلوبة من المستعمرة البكتيرية المناسبة، أذب بضع حبيبات من ole في 30 µL من الماء، وأضف من 1 إلى 2 µL من عامل الشلل هذا لكل 50 µL من عينة النيماتودا. ثم انقل حوالي 20 إلى 30 µL من عينة النيماتودا المشلولة إلى شريحة مجهرية وضع غطاء الشريحة فوق العينة. افحص النيماتودا باستخدام المجهر الضوئي للتأكد من وجودها في مجال الرؤية.

لتحديد تموضع البكتيريا، قم بتصوير الديدان الخيطية باستخدام المجهر الفلوري بالإضافة إلى إعدادات المجهر الضوئي، ثم قم بدمج الصور. قد يكون من الضروري تجربة عدة تكبيرات وزوايا رؤية للديدان الخيطية للعثور على البكتيريا.

تم عدّ مجموعة من النيماتودا من وسطين مختلفين وتقييم مدى استعمارها بواسطة المتعايش البكتيري. ولضمان الحصول على إحصائيات قوية، يفضل عدّ 100 نيماتودا على الأقل لكل عينة، على أن يندرج 30 منها على الأقل ضمن كل فئة كما هو موضح في الجدول. وقد تم استعمار هذه النيماتودا بنسبة تقارب 14.6% عند تنميتها على أغار الدهون (lipid agar)، وبنسبة 68.6% عند تنميتها على أغار الكبد والكلى (liver, kidney agar).

لقد ثبت أن أنواعاً أخرى من النيماتودا والبكتيريا تمتلك مستويات استعمار مختلفة. يوضح هذا المخطط المظهر العام لإناث Steiner NEMA. ويظهر الشكل المدرج صورة تباين التداخل التفاضلي لأنثى S fot عند تكبير 20 x.

يشير السهم الأسود في الصورة المدرجة إلى الفتحة التناسلية، بينما تشير السهم البيضاء إلى البيوض المرئية. تُظهر هذه الصورة بيضة نيماتودا volt نمت ولكنها لم تفقس بعد بتكبير 40x، وقد تم تصوير هذه البيوض المعزولة من نيماتودا s Volta بتكبير 10x. وتظهر هنا في هذه الصورة الأولى صور مجهرية ممثلة لنيماتودا Steiner Nima المرتبطة ببكتيريا Xeno aptus.

ارتبطت نيماتودا Alvin بمتكافلاتها البكتيرية التي تعبر عن GFP لإنشاء هذه الصورة المركبة. تم دمج صورة تباين طوري مع صورة فلورية. يشير السهم إلى البكتيريا الموجودة داخل النيماتودا اليرقية المعدية.

تظهر هذه الصورة نيماتودا يافعة من نوع S carpa capsi مع X nla المعبرة عن البروتين الفلوري الأخضر GFP. تم إنشاء الصورة بطريقة مماثلة للصورة السابقة، وهي تصور النيماتودا اليافعة مع بكتيريا موسومة بالبروتين الفلوري الأخضر، والتي تظهر كعصيات خضراء متمركزة في جميع أنحاء لمعة أمعاء النيماتودا. بالإضافة إلى الإجراء الموصوف، يمكن دمج طرق أخرى مثل التلاعب الجيني للمتعايش البكتيري قبل الارتباط بالعائل النيماتودي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي الآليات الجزيئية الضرورية لارتباط العائل بالميكروب.