على

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل النشاط الكهربائي من الأعصاب والعضلات والعصبونات، والحركات المقابلة لجهاز التغذية أثناء برامج التغذية الحركية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الكتلة البلعومية من حلزون مخدّر وتثبيت أقطاب خطافية بالأعصاب والعضلات الرئيسية. وتتمثل الخطوة الثانية في وضع الكتلة البلعومية في طبق تسجيل وتجهيز العقد العصبية للتسجيل خارج الخلوي.

بعد ذلك، يتم تحديد موقع العصبونات المستهدفة باستخدام أقطاب كهربائية خارج خلوية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحفيز وتسجيل البرامج الحركية للتغذية، مثل العض والبلع والرفض. وفي النهاية، يُستخدم تحضير الكتلة الفمويّة المعلقة لإظهار نشاط الأعصاب والعضلات والعصبونات الفردية أثناء حركات مختلفة تشبه التغذية في الكتلة الفمويّة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل دراسات العقد العصبية المعزولة، في إمكانية ربط التسجيلات المأخوذة من الأعصاب والعضلات والعصبونات الفردية بشكل مباشر بحركات جهاز التغذية. سيساعد في توضيح الإجراء huu، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. لبدء الإجراء، يتم تخدير حيوان plegia سليم يزن ما بين 200 إلى 300 gram في صينية تشريح عن طريق حقن حوالي 50% من وزن الجسم من كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر. بعد الحقنة الأولى بالقرب من ذيل الحيوان، يتم تدليك سطح جسم الحيوان برفق لتوزيع كلوريد المغنيسيوم.

قم بإعطاء حقن إضافية بالقرب من رأس الحيوان حسب الحاجة. وبعد أن يتوقف الحيوان عن الاستجابة للمنبهات اللمسية الخفيفة، ثبته بالدبابيس على الصينية بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. ضع دبوساً واحداً في الذيل ودبوساً واحداً في كل مجس أمامي.

بعد ذلك، استخدم الملقط لقرص ورفع جلد الحيوان في منتصف الرأس. خلف الـ rhino fours، قم بإجراء شق إكليلي عبر رأس الحيوان خلف النقطة الممسوكة مباشرة. بعد ذلك، قم بإجراء شق سهمي متوسط بين الـ rhino fours باتجاه الفم للكشف عن الكتلة الشدقية.

بعد ذلك، اسحب سديلة الجلد بعيداً عن الكتلة الفموية واقطع الأعصاب والأنسجة الضامة التي تربطها بجدار الجسم. ومن أجل فصل سديلة الجلد هذه تماماً عن الكتلة الفموية، تأكد من عدم قطع أي أعصاب أو أنسجة داخلية تابعة للكتلة الفموية. بعد ذلك، أمسك المريء وثبته.

اقطع المريء خلف النقطة التي يتم تثبيتها. اسحب المريء للأعلى وارفع الكتلة الفمية من خلفها. تشكل العقد الدماغية والبلعومية والقدمية حلقة، حيث ترتبط العقدة الدماغية بالعقد الفمية عبر الموصلات الدماغية الفمية.

اترك هذه العقد الحلقية متصلة بالكتلة الفموية، واقطع جميع الأعصاب الممتدة من هذه العقد إلى أجزاء الجسم الأخرى. بعد ذلك، اقطع النسيج الضام المحيط بالكتلة الفموية واستمر في رفع الكتلة الفموية للأعلى مع تضاؤل ارتباطها بالجسم. وبمجرد أن تصبح الكتلة الفموية متصلة بالفم فقط، أمسك بالمريء وبالكتلة الفموية.

قم بإجراء قطع مستقيم، مع القيام بقطع نهائي أمام الفكين مباشرة لتحرير الكتلة الخدية من الجسم. ضع الكتلة الخدية في محلول يتكون من 50% من محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر و 50% من محلول SIA الملحي للحفاظ على تخدير جزئي أثناء تركيب الأقطاب الكهربائية.

بعد ذلك، ضع الكتلة الفموية مع المحلول في طبق بتري ذو قاعدة مقعرة (cigar bottom)، مع إجراء قطع عبر الشريان الفموي الموجود على السطح البطني للكتلة الفموية. ثم قم بإزالة العقد الجنبية والقدمية عن طريق قطع وصلاتها بالعقدة الدماغية. اترك العقدة الدماغية متصلة بالعقد الفموية والكتلة الفموية عبر الخلايا الرابطة الدماغية الفموية (CBCs)، واقطع الوصلات الأخرى بين العقدة الدماغية والكتلة الفموية.

قم بتقليم المريء والغدد اللعابية إلى أطوال قصيرة. في هذه الخطوة، قم بتثبيت الأقطاب الكهربائية ذات الخطاف في عين العصب العضدي، والعصبين العضليين الخديين الثاني والثالث، والفرع A من العصب الخدي الثاني. وذلك باستخدام إجراء مشابه لما تم توضيحه في منشور JoVE بواسطة Collins و Shield، والموجز هنا باختصار.

عند كل عملية فصل للقطب الكهربائي، ضع القطب بالقرب من العصب أو العضلة، ثم ضع العصب المستهدف في الخطاف وارفعه برفق باستخدام أداة المناولة. بعد ذلك، جفف جزء العصب باستخدام منديل Kim wipe. ضع كمية صغيرة من غراء quick gel super glue على العصب المثبت بالخطاف، وتأكد من تغطية الخطاف بالكامل بالغراء مع ضمان عدم تغطية طرف سلك المرجع بالغراء.

بعد ذلك، تُستخدم سرنجة متصلة بأنبوب من البولي إيثيلين لوضع المحلول من الطبق فوق الغراء، مما يحفز سطح الغراء على التصلب. الخطوة التالية هي تحضير طبق تسجيل دائري من البايركس بمقاس 100 في 50 millimeter لاستخدامه كغرفة تسجيل؛ حيث يتم وضع طبقة رقيقة من شحم الفراغ على الثلمة الموجودة بين الغرفتين الدماغية والمنحنية باستخدام رأس ماصة لتقليل التسريب. ثم تُملأ الغرفة الأمامية بمحلول ملحي من نوع plescia.

انقل كتلة الخلايا الطلائية من أطباق بتري بعناية إلى الغرفة الأمامية لطبق بايركس المستدير، مع التأكد من عدم شد أي من الأقطاب الكهربائية بقوة، حيث قد يؤدي ذلك إلى قطع الأعصاب. كن حذراً للغاية عند التعامل مع الأقطاب الخطافية إذا كان من الضروري نقل الطبق إلى مجهر تشريح ثنائي العينية آخر. وذلك لترقيق الغمد.

قم بتجميع الأقطاب الكهربائية على كل جانب من الكتلة الشدقية معاً. أمسك الأقطاب الكهربائية بعناية من خلال الإمساك بشريط المختبر الذي يغطي دبابيس الموصل، وتأكد مجدداً من عدم شد أي من الأقطاب بقوة. عند وضع الطبق تحت المجهر، يجب أن تتدلى الأقطاب الكهربائية برفق فوق جوانب الطبق وتستقر على المنصة أثناء فترات الاستراحة وبين مراحل التجربة، وقم بتهوية المحلول الملحي في حجرة الكتلة الشدقية باستخدام حجر هواء خاص بأحواض السمك.

بعد ذلك، قم بتثبيت العقدة الدماغية في الغرفة الخلفية مع تمرير الـ CBCs عبر الثلمة. ضع المزيد من شحم الفراغ فوق الـ CBCs. ثم أضف المزيد من محلول SIA الملحى إلى كلا جزئي الطبق بحيث تكون العقد مغمورة بالكامل.

تأكد من أن مستوى المحلول الملحي أقل من ارتفاع شحم الفراغ الموجود بين الحجرتين الدماغية والفموية لضمان عدم حدوث تسرب بين الحجرتين. في هذه المرحلة، يجب أن تستقر الكتلة الفموية في قاع الحجرة الأمامية. بعد ذلك، قم بتثبيت العقد الفموية على المنصة الوسطى باستخدام الدبابيس لتجنب إتلاف الأعصاب التي لا تزال متصلة بالكتلة الفموية.

ضع الدبابيس فقط على الغمد الموجود بين عصبين. بعد ذلك، أضف دبوسين إضافيين على جانب الـ CBCs لمدها وتثبيتها. حافظ على بقاء العقد البكلية مسطحة أو مدورة بناءً على موقع العصبونات محل الاهتمام.

لتدوير العقدة الشدقية، استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بجزء زائد من غمد CBC وتثبيته بدبوس بين العصب الشدقي الثاني والعصب الشدقي الثالث. وعندها يمكن رؤية معظم أجسام الخلايا القريبة من الغرفة الخلفية والتي لا يمكن الوصول إليها بسهولة من الجزء العلوي للعقدة الشدقية. وأخيراً، ضع دبوسين على غمد العقدة الشدقية في الجانب القريب من الكتلة الشدقية.

لتقليل حركة العقدة البلعومية، أمسك بغمد العقدة البلعومية بالقرب من الغرفة الخلفية وقص الغمد الزائد باستخدام مقص دقيق دون كشف أجسام الخلايا. ومن أجل تقليل الضرر، قم بإزالة كمية الغمد الضرورية فقط لرؤية أجسام الخلايا بعد الانتهاء من ترقيق الغمد. قم بتوصيل جميع دبابيس الأقطاب الكهربائية بمقابسها الموجودة على الكابلات المتصلة بالمضخمات.

تأكد من أن الأقطاب الكهربائية ليست مشدودة بقوة ومثبتة بشكل صحيح في الكابلات المناسبة لها وأن الأقطاب صحيحة لغسل أي كلوريد المغنيسيوم المتبقي. استبدل محلول SIA الملحي في غرفة الكتلة الخدية بمحلول SIA ملحي جديد. بعد ذلك، مرر خيط جراحة حريري عبر الأنسجة الرخوة في مقدمة الكتلة الخدية وظهرياً لغضروف الفك.

استخدم قطعتين من صلصال النمذجة لتثبيت الغرزة بحافة الطبق، وبذلك يتم تعليق الكتلة الفموية من موضع طرفها الأمامي. استخدم جهاز تلاعب لإمساك قطب كهربائي خارج خلوي زجاجي بحيث يكون طرف القطب بالقرب من العقدة الفموية. ولتحديد موقع العصبون والتعرف عليه، أنزل طرف القطب خارج الخلوي برفق فوق الغمد.

فوق جسم العصبون. يتم تطبيق تيار تحفيزي ثم يتم تحويل القناة المستخدمة لإثارة جسم العصبون إلى وضع التسجيل، وذلك لتسجيل النشاط على القطب الكهربائي خارج الخلية والنشاط المقابل على الأعصاب لتحفيز الرفض. ومثل البرامج الحركية، يتم تحفيز العصب الفموي 2A بسلسلة طويلة من نبضات بتردد 2 Hz وبمدة 1 ms لتوليد أنماط ees.

تستمر هذه الأنماط طوال فترة التحفيز وقد تستمر حتى وقت قصير بعد انتهائه. ولتحفيز برامج حركية مشابهة للعض، ضع بضع بلورات من مادة caracol الصلبة مباشرة على العقدة الدماغية.

تبدأ الأنماط التكرارية عموماً في غضون خمس دقائق وتستمر لمدة تتراوح تقريباً بين 10 إلى 15 دقيقة قبل أن تبدأ في التلاشي لتحفيز عملية البلع. وكما هو الحال في البرامج الحركية، قم بتطبيق caracol والانتظار حتى تولد الكتلة الفموية عضات قوية. بعد ذلك، وأثناء العض، ضع شريطاً من الأعشاب البحرية في فم الحيوان بحيث يمسك بالأعشاب البحرية.

فيما يلي عملية التحفيز والتسجيل للعصبون الحركي المحدد B nine، والتسجيل من العصبون نفسه، والعضلة I two، والعديد من الأعصاب أثناء برامج الحركة الخاصة بالتغذية. وهنا تظهر الصور المرئية المأخوذة من السلسلة ذاتها من برامج الحركة. وقد تم تحفيز أنماط البلع عن طريق تطبيق الكارباكول على العقدة الدماغية، ثم وضع شريط من الأعشاب البحرية في الممسك أثناء عملية العض المستحثة بواسطة الكارباكول.

في هذه الصورة، يمتد الـ ragula للإمساك بالطحالب البحرية، وفي هذه الصورة، ينكمش الـ ragula ساحباً الطحالب البحرية إلى داخل الفم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تحضير الكتلة الفموية المعلقة، والحصول على تسجيلات لبرامج الحركة التغذوية في المختبر (in vitro).