مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج خلايا مقدمة للمستضد اصطناعية تعتمد على CD 1D أو A APC لتوسيع الخلايا التائية القاتلة الطبيعية NK T cells. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة بروتينات لتفعيل الخرز المغناطيسي وظيفياً. وفي الخطوة الثانية، يتم إثراء مجموعة خلايا NK T cells الأولية المستخلصة من الدم المحيطي.

بعد ذلك، يتمت زراعة الخلايا التائية المخصبة بشكل مشترك مع A A PC. وفي الخطوة النهائية، يتم تقييم النمط الظاهري ووظيفة مجتمع خلايا A A PC. وفي نهاية المطاف، يمكن تحديد نقاء المجموعات الفرعية للخلايا التائية المتوسعة عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. والميزة الرئيسية لـ APCs مقارنة بالطرق الحالية التي تستخدم الخلايا التغصنية هي إمكانية وجود تباين عالٍ بين المانحين في حالة الخلايا التغصنية.

توفر الخلايا العارضة للمستضدات الاصطناعية (APCs) طريقة قياسية وقابلة للتكرار وجاهزة للاستخدام لتوسيع خلايا NK T. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت أعمل مع الدكتور Schneck وزميله في جامعة جونز هوبكنز، حيث كانوا رواداً في مجال استخدام المجمعات الاصطناعية العارضة للمستضدات لتوسيع مجموعات خلايا CD8 T التقليدية.

سيقوم بشرح الإجراء الدكتور James East، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وابن الدكتورة Wendy، وهو باحث مساعد من مختبري. ابدأ بنقل 1 mL من حبيبات dyna bead M four 50 epoxy إلى قارورة زجاجية شفافة من البوروسيليكات سعة 5 mL ذات غطاء لولبي. ثم اشطف الحبيبات باستخدام 3 mL من sterile bore eight buffer في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 1.5 mL.

أضف 100 µg من human CD 1D IG dimer، و 20 µg من الجزيئات التحفيزية المشتركة المطلوبة إلى 1 mL من PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك، ضع القارورة الزجاجية التي تحتوي على الخرزات على مغناطيس وقم بشفط borate buffer. ثم أضف خليط البروتين إلى القارورة الزجاجية وأعد إغلاق الغطاء.

امزج المحلول فوراً عن طريق قلب القارورة، ثم غطِّ الغطاء بـ paraform وضعها على جهاز تدوير طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، ضع القارورة الزجاجية على المغناطيس مرة أخرى وأزل خليط البروتين بعناية مع تجنب ملامسة الخرزات. اغسل الخرزات ثلاث مرات بإضافة 3 mL من منظم غسل الخرزات (bead wash buffer) وتحضينها على جهاز التدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 5 دقائق.

للتأكد من تحميل البروتينات بشكل مستقر على الخرزات، قم بصبغ جزء من الخرزات باستخدام الأجسام المضادة وتحليلها بواسطة تحليل قياس التدفق الخلوي. الآن، انقل 5 × 10⁷ من الخرزات إلى قارورة زجاجية صغيرة سعة 1.5 milliliter واشطف الخرزات بـ 1 milliliter من PBS المعقم. ثم يتم ذلك قبل 48 إلى 72 ساعة من الاستخدام.

قم بتحميل الخرزات المغسولة بالمستضد في 1 mL من محلول PBS المعقم أثناء عملية تحميل الخرزات بالمستضد. اجمع خلايا PBMC عن طريق تخفيف دم المتبرع المضاف إليه الهيبارين أولاً بحجم مساوٍ من محلول PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 15 mL من محلول PHI في درجة حرارة الغرفة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 mL، ثم ضع ببطء 25 mL من خليط الدم المخفف فوق طبقة PHI.

بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً لمدة 30 دقيقة عند 700 ×g وفي درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكابح. استخدم ماصة باستور لنقل الواجهة الليمفاوية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك، اغسل الخلايا الليمفاوية في 50 ملليلتر من PBS، مع التخلص من المادة الطافية ودمج الأنابيب الخاصة بالمانح الواحد في أنبوب واحد.

بعد غسل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) مرة أخرى باستخدام 20 milliliters من PBS، قم بعد الخلايا ثم أعد تعليقها بتركيز 5 × 10⁷ خلية لكل milliliter في max buffer. لعزل جزء الخلايا التائية (T-cell)، قم بتحضين 100 µL من محلول إثراء الخلايا التائية PAN من مجموعة EP human T-cell enrichment مع 2 milliliters من PBMC لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتحضين المحلول مع 100 µL من الخرزات المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أخرى.

أكمل الحجم النهائي للمذيب إلى 2.5 milliliters ثم ضع الأنبوب في المغناطيس. بعد مرور خمس دقائق، صب الجزء الموجب CD three بسرعة في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. الآن، اغسل الخلايا في 5 milliliters من max buffer البارد، وقم بعدها بعد الخلايا الحية.

اسحب عينة صغيرة للصباغة التحققية لاختيار الخلايا الموجبة لـ CD 1 61 أولاً. أعد تعليق الخلايا التائية المخصبة في 980 µL من منظم max البارد مبردًا بالثلج، ثم حضن الخلايا مع 10 µg من الجسم المضاد أحادي النسيلة anti CD 1 61 لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد غسل الخلايا، أعد تشكيل الراسب في 800 µL من منظم max و 200 µL من حبيبات anti-US IgG 1 الدقيقة.

يتم تحضين هذا المحلول عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق أخرى. وأثناء تحضين الخلايا مع الخرزات الدقيقة، أضف 3 mL من منظم max buffer لموازنة عمود LS. وبعد غسل هذا الجزء من الخلايا، انقل الخلايا الموجودة في 3 mL من منظم max buffer ببطء إلى العمود باستخدام الماصة.

الآن اشطف العمود ثلاث مرات باستخدام 3 mL من محلول max buffer الجديد. بعد ذلك، أضف 3 mL أخرى من محلول max buffer الجديد إلى العمود، ثم انقل العمود إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. قم بإخراج خلايا CD161+ CD3+ المنقاة، ثم قم بعدّ الجزء المخصب من خلايا NKT.

ابدأ هذه الخطوة باستزراع مشترك لـ 10⁶ من خلايا T المخصبة والموجبة لـ CD161 وCD3، و 10⁶ من خلايا AAPC في 16 ملليلتر من الوسط الكامل. وزع 160 ميكرولتر من المزرعة المشتركة في كل بئر من ألواح البوليستيرين ذات القاع على شكل U المكونة من 96 بئراً والمعالجة لزراعة الأنسجة، مع استخدام غطاء منخفض التبخير. في اليوم 12 إلى 14، قم بحصد الخلايا وعدّها. حلل المجموعات الخلوية باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي، ثم كرر عملية إعادة الاستزراع والاستزراع المشترك.

بعد تجميد خلايا NKT الإضافية عقب الجولة الثانية من التوسع كما تم توضيحه للتو، يتم اختبار وظائف خلايا A A PC عن طريق الاستزراع المشترك أولاً لـ 5×10⁴ من خلايا NKT لكل بئر مع 5×10⁵ من A A PC في حجم نهائي قدره 200 µL من الوسط الكامل في طبق 96 بئراً ذو قاع على شكل حرف U. وبعد مرور 24 إلى 48 ساعة، يتم جمع supernatant المزرعة الخلوية لتحليله بواسطة ELISA. يوضح الشكل الأول أن بروتينات CD 1D IG مثبتة بشكل مستقر على سطح الخرزات المغناطيسية كما هو موضح هنا.

يتم التعبير عن كل من أجسام CD 1D IG والأجسام المضادة anti CD 28 على سطح الخرز المغناطيسي كما هو موضح في هذا الرسم البياني. تم إجراء استزراع مشترك لخلايا هجين NK T الفأرية DN 30 2D three الموجبة لـ V alpha 14 مع خلايا A A PC إما غير محملة بمستضد alpha galera الذائب في الوسط أو محملة بـ alpha gal. ثم تم جمع المادة الطافية من المزارع، وقِيست عملية إنتاج IL two بواسطة تقنية Eliza، مما يوفر طريقة بسيطة لاختبار كل دفعة من الخلايا المقدمة للمستضد. في هذه التجربة، تم إثراء خلايا T من الدم المحيطي البشري الموجبة لـ CD 1 61 والموجبة لـ CD three عن طريق الفصل باستخدام الخرز المغناطيسي.

تم تحفيز الخلايا بعد ذلك مرة واحدة أسبوعياً لمدة 14 يوماً باستخدام alpha galera المحمل على A A PC، ثم حُللت للتعبير عن V alpha 24 وV beta 11. ومن المهم ملاحظة أنه تبيّن أنه حتى مع وجود مجموعة أولية منخفضة نسبياً من خلايا NKT تبلغ 0.03%، فقد أمكن توسيع الخلايا لتصل إلى مجموعة موجبة لـ V alpha 24 وموجبة لـ V beta 11 بنسبة 67% تقريباً. هنا، تم تحضين خلايا C one R CD 1D مع خلايا NKT بالنسب الموضحة في وجود أو غياب مستضد Alpha Gal SER في أطباق U bottom ذات 96 بئراً لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة.

تم بعد ذلك تقييم تحلل الخلايا الذي تتوسطه خلايا NKT لخط خلايا سرطان اللمفوما B باستخدام مقايسة تحرر الكروم. كانت خلايا NKT الموسعة من PC قادرة على تحلل خط خلايا اللمفوما هذا. في وجود أو غياب alpha galera، تم توسيع خلايا NKT من PBMC لكل من المتطوعين الأصحاء ومرضى السرطان، وتم تحميل alpha galera.

تمكنت خلايا PC من توسيع مجموعات خلايا NKT من كلتا المجموعتين. عند استخدام مجموعة بدائية مكونة من 2 مليون خلية T موجبة لـ CD 1 61 وموجبة لـ CD three، يمكن الحصول على أكثر من 10^7 خلية بعد جولتين من التوسيع. ويمكن استخدام خلايا NKT الموسعة في الدراسات الوظيفية كما هو موضح هنا.

تظل خلايا NKT التي تم تكثيرها خارج الجسم مستجيبة لتحفيز Alpha GAL وتعتبر منتجة بقوة لـ IL 17 A وTNF alpha وإنترفيرون gamma. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا كانت مجموعة إثراء الخلايا التائية الأولية منخفضة وتعذر إجراء خطوة إثراء CD 1 61 الثانية، فقد لا يؤدي التكثير بوساطة A A PC إلى النتائج المتوقعة. ومع ذلك، إذا كانت نسبة خلايا NKT الدورية أعلى من 0.1%، فمن المفترض أن يظل من الممكن الحصول على تكثير ملحوظ لخلايا NKT غير المتغيرة.

تُظهر هذه البيانات مجتمعة أن خلايا A A PC القائمة على CD 1D يمكن استخدامها لتوسيع وتحفيز خلايا NK T البشرية الأولية بشكل فعال بعد هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل QPCR من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي حركية تنشيط خلايا NK T بعد تطويرها. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكبد لاستكشاف دور خلايا NKT في مرض الكبد الدهني.