تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

الهدف العام من نموذج التهاب القولون الذي يحركه المستضد هو تحديد ما إذا كانت الخلايا البلعمية أحادية النواة الإيجابية CX3 و CR1 تتفاعل مع الخلايا التائية الإيجابية CD4 وتنشطها أثناء التهاب القولون الخاص بالمستضد وما إذا كان هذا المستجيب المعتمد على الخلايا البلعمية أحادية النواة يحدث داخل الصفيحة المعوية الخاصة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض التهاب الأمعاء ، مثل أنواع التفاعل التي تحدث داخل الخلايا العارضة للمستضد والخلايا التائية المستجيبة في الصفيحة القولونية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة تفاعل الخلايا المناعية والعناصر التي تؤدي إلى إمراض مرض التهاب الأمعاء.

تستخدم هذه الطريقة نموذج التهاب القولون لنقل الخلايا التائية ، حيث يتم نقل خلايا CD4 T الساذجة الخاصة بمستضد الفلورسنت الأحمر إلى المضيف الذي يعاني من نقص المناعة ، مما يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا أحادية النواة. يتبع نقل الخلايا التزقيم الفموي للبكتيريا التي تعبر عن مستضد الفلورسنت الأزرق. يمكن مراقبة الأحداث المناعية التي تحدث في الصفيحة المعوية للمضيفين في مراحل مختلفة من تطور المرض.

استخدم مقص التشريح لفتح القولون طوليا وغسل المنديل في طبق بتري يحتوي على 25 مل من PBS لإزالة أي حطام ومخاط. قطع القولون إلى قطع من خمسة إلى ثمانية ملليمترات وضع الأجزاء الناتجة في 20 مل من DPBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال عشرة ملليمولار HEPES وخمسة مللي مولار EDTA. دوامة الأنبوب مع العينة لمدة 30 ثانية على السرعة القصوى.

ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق مع رج لطيف لإزالة الظهارة. في نهاية الحضانة ، دوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. ثم تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الظهارية.

انقل قطع المناديل إلى أنبوب جديد يحتوي على 20 مل من PBS و HEPES و EDTA الطازج ، وكرر الحضانة بخطوات الدوامة قبل وبعد. بعد التكرار الثالث ، تتم إزالة جميع الخلايا الظهارية ويكون المادة الطافية واضحة. اغسل شظايا الأنسجة برفق في PBS لإزالة أي خلايا ظهارية متبقية.

قم بتقطيع شظايا الأنسجة إلى قطعتين في ملليمترين ونقل القطع للهضم في عشرة ملليمترات من وسط RPI ، مع استكمال 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من نوع الكولاجيناز من النوع ثمانية وعشر وحدات لكل مليلتر من الحمض النووي واحد. دوامة العينات لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم باحتضان قطع المناديل على حرارة 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 30 إلى 35 دقيقة وقم بدوامة الأنبوب كل خمس دقائق أثناء الحضانة.

عندما يتم هضم الأنسجة ، قم بتصفية الملاط الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل مصفاة الخلية مرة واحدة وقم بتدوير معلق الخلية المفردة عن طريق الطرد المركزي. أخيرا ، اغسل الخلايا مرة واحدة في PBS وأجهزة الطرد المركزي.

ثم حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد التريبان الأزرق. بروتين الفلورسنت السماوي ينتج بروتين البيضافي الإشريكية القولونية ينشط إنتاج إنترفيرون جاما في خلايا OT-II في المختبر على عكس E.

القولونية التي تعبر عن CFP فقط. Ex vivo 3D التصوير متحد البؤر لأنسجة القولون لبروتين الفلورسنت الأخضر المعدلة وراثيا الذي يعبر عن الفئران ، الذي يتغذى على بكتريا قولونية PCFP يوضح البويضات وجود البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري داخل الخبايا القولونية بالقرب من الخلايا الظهارية المعوية ومتوضعة مع الخلايا البلعمية المعوية المضيفة.

في الحمراء OT-II ، تتميز الخلايا التائية الإيجابية CD4 بتعبيرها المشترك عن البروتين الفلوري الأحمر و V beta خمس نقاط واحد. عند التحدي مع بكتريا قولونية PCFP البويضات ، الفئران المعدلة وراثيا بالبروتين الفلوري الأخضر التي تعاني من نقص الخلايا الليمفاوية BNT والتي تم زرعها بالتبني مع الخلايا التائية الإيجابية CD62 الحمراء OT-II CD62 الإيجابية تفقد وزن الجسم بسرعة وتظهر علامات سريرية لالتهاب القولون.

بعد سبعة أيام من نقل الخلايا ، لم يتم أخذ عينات سوى عدد قليل من الخلايا البلعمية المضيفة من بكتريا قولونية PCFP البويضات ولم يتم اكتشاف الخلايا الإيجابية الحمراء OT-II. بعد 14 يوما من نقل الخلايا ، الخلايا البلعمية المضيفة التي أخذت عينات من E.

بويضات القولونية PCFP على مقربة من الخلايا الحمراء الإيجابية OT-II المنقولة بالتبني. بحلول 21 يوما بعد نقل الخلايا ، قام عدد كبير من الخلايا المضيفة بأخذ عينات من بكتريا قولونية بويضات PCFP والخلايا الإيجابية الحمراء OT-II المانحة ، والتي تم العثور عليها منتشرة في جميع أنحاء الصفيحة القولونية المخصوصة ، على اتصال وثيق بالخلايا البلعمية المعوية المضيفة.

عند إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الخلايا الليمفاوية المعوية وتحليل السيتوكين في الدم للإجابة على أسئلة إضافية حول حالة تنشيط الخلايا التائية CD4 وتأكيد شدة التهاب القولون. بعد كل تطور ، تمهد هذه التقنية الطريق للبحث في مجال وعلم المناعة لاستكشاف الأحداث الصغيرة التي تؤدي إلى مرض التهاب الأمعاء في نموذج الفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المناعية للصفيحة القولونية لتحليل خارج الجسم الحي.