قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم النوم والوظيفة المناعية في ذبابة الدروزوفيلا (drosophila). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تسجيل النشاط الحركي للذباب المصاب لقياس النوم والبقاء على قيد الحياة، وكخطوة ثانية بعد ذلك يتم تجنيس الذباب المصاب وتخفيفه ونشره على أطباق أغار LB. ويشير عدد الوحدات المكونة للمستعمرات التي تنمو إلى قدرة الذباب على التخلص من العدوى.

بعد ذلك، تُضاف الذباب المصابة التي تُعبّر عن جين منقول يحتوي على مراسل NF kappa b luciferase إلى طبق مكون من 96 بئراً يحتوي على luciferian، وهي المادة الخاضعة للتفاعل لإنزيم luciferase. ويشير القياس الفوري لـ kappa b Luciferase إلى تنشيط مسار إشارات NF kappa B أثناء العدوى، والذي يرتبط في المجمل بنتيجة البقاء على قيد الحياة أثناء النوم. ويعد التخلص من البكتيريا ونشاط مراسل NF KB من القياسات التي توفر رؤية ميكانيكية حول الرابط الجزيئي بين الوظيفة المناعية والسلوك.

بشكل عام، يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن تعلم كيفية حقن الذباب يدوياً وبشكل متسق يتطلب وقتاً وممارسة. وتكمن الميزة الرئيسية لتقنية لوسيفيراز المذكورة مقارنة بالطرق الحالية مثل QPCR في إمكانية قياس نشاط NF Kappa B بشكل مستمر وفي الوقت الفعلي داخل الذباب الحي. ابدأ بحضانة مزارع Drosophila في مرحلة العذراء المتأخرة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، لكي تتكيف الحشرات البالغة مع الظروف البيئية.

هنا يتم وضع الذباب تحت إضاءة مستمرة لإزالة تأثير الساعة البيولوجية على الاستجابة المناعية والسلوك. بعد ذلك، يتم وضع ذباب يتراوح عمره من يوم إلى أربعة أيام في أجهزة مراقبة النشاط، حيث تقوم هذه الأجهزة بتسجيل نشاطها لمدة ثلاثة أيام على الأقل قبل العدوى، وذلك قبل يوم واحد من موعد العدوى المقرر.

التقط مستعمرة واحدة من وسط SIA باستخدام طرف ماصة معقم، ثم اغمس الطرف في أنبوب مزرعة يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط LB للتحقق من تقنية التعقيم. لا تنسَ إعداد مزرعة ضابطة وهمية (mock culture) خالية من البكتيريا. قم بتنمية البكتيريا طوال الليل حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي في اليوم التالي.

قم بقياس امتصاصية المزرعة عند 600 نانومتر. استخدم أنبوب Q vet ثانيًا كعينة فارغة (blank). تكون المزرعة جاهزة عندما يتراوح التركيز بين 0.5 إلى 1 وحدة امتصاصية للنقل الفرعي، أو قم بتمديد وقت الزراعة حسب الحاجة.

قم الآن بتحضير المحلول البكتيري لإصابة الذباب. خفف البكتيريا باستخدام PBS لتصل الامتصاصية المتوقعة إلى 0.1 عند 600 نانومتر. بعد ذلك، أضف صبغة الطعام لاستخدامها كعنصر تحكم في عملية الحقن.

استبدل البكتيريا بوسط LB. احفظ كلا المحلولين على الثلج. بعد ذلك، وباستخدام سحّاب الماصات الدقيقة (micro pipette puller)، اصنع إبر حقن ذات سن رفيع تحت مجهر تشريحي.

استخدم ملقطاً دقيقاً لكسر طرف كل إبرة بحيث تكون الفتحة واسعة بما يكفي للتعبئة بسائل الحقن عن طريق السحب، وفي الوقت نفسه صغيرة بما يكفي لتقليل الضرر الذي يلحق بالذبابة. قم بتوصيل إبرة زجاجية بمحقنة بلاستيكية سعة 3 cc باستخدام قطعة من الأنبوب. يتم التحكم في تدفق وسط الحقن يدوياً.

تجنب تلوث الأنابيب المطاطية بسائل الحقن نظراً لاستخدام جهاز المحقنة لكل من الحقن المعدي وحقن التحكم. تحقق من تدفق وسط الحقن باستخدام منديل Kim wipe. ثمة تفصيلان حاسمان لنجاح عملية الحقن، وهما استخدام الحجم الأمثل للإبرة وضمان الإحكام التام بين الإبرة والمحقنة.

بمجرد تجهيز نظام الحقن بالكامل، يتم تخدير الذباب باستخدام تدفق أدنى من ثاني أكسيد الكربون، مع المضي قدماً وبسرعة لضمان عدم بقاء أي ذبابة تحت التخدير لأكثر من خمس دقائق. الآن، يتم حقن الذباب عن طريق غرز الإبرة الزجاجية في المنطقة الموجودة فوق scutellum في الصدر الظهري. ويتم التحقق من مرور وسط الحقن إلى داخل الذبابة عن طريق ملون الطعام، والذي يمكن رؤيته مع انتشار المحلول المحقون.

قبل البدء، تأكد من تعقيم جميع المواد المستخدمة في هذا الإجراء بجهاز الموصدة (autoclave) قبل يوم واحد على الأقل. قم بتجهيز أطباق بتري بقطر 10 centimeter باستخدام وسط LV agar. وفي يوم التجربة، قم بتخدير الذباب ووضعه في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter.

قم بتجهيز مجموعتين على الأقل من الذباب، بحيث تضم كل مجموعة 10 ذباب لكل حالة تجريبية. كما يجب تجهيز مجموعة ضابطة من الذباب غير المصاب، خاصة عند استخدام سلالة بكتيرية تفتقر إلى مقاومة المضادات الحيوية. تُحفظ جميع الأنابيب المُحمَّلة على الثلج.

بعد ذلك، أضف 400 µL من وسط LB إلى كل أنبوب محمل بالذباب. قم بتجنيس الذباب باستخدام عود صغير، وقم بذلك بالقرب من لهب لمنع التلوث. الآن، وباستخدام رؤوس ماصات مقطوعة، قم بإجراء تخفيف تسلسلي للمجانس بنسب 10 في أحجام قدرها 200 µL.

إذا تم تحضير المتجانس مباشرة بعد العدوى بـ sia، فقم بإجراء تخفيفات تصل إلى 1:1000، أما بالنسبة للمتجانس بعد 24 ساعة من العدوى، فقم بإجراء تخفيفات تصل إلى 1:100,000. بعد ذلك، قم بنثر أكبر تخفيفين على أطباق بقطر 10 سنتيمتر باستخدام كرات زجاجية لضمان التوزيع المتساوي، ثم حضن الأطباق طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بحساب عدد المستعمرات الموجودة على الطبق عن طريق الملاحظة المباشرة أو باستخدام برنامج عد المستعمرات.

احسب بعد ذلك عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لكل ذبابة. يستخدم هذا المقايسة ذباباً معدلاً وراثياً يحمل مراسل luciferase kappa b في الوقت المناسب. تتطلب المقايسة أيضاً بكتيريا مستزرعة مثل SCIA تم تحضيرها للحقن كما هو موضح في القسم السابق.

قم بتكييف الذباب مع ظروف الإضاءة التجريبية. في هذا المثال، يتم إيواء ذباب kappa b luciferase التي يتراوح عمرها من يوم إلى أربعة أيام في قنينات تحتوي على وسط غذائي مكون من 5% sucrose و 2% agar، وتوضع في إضاءة مستمرة لمدة يومين. الآن قم بتجهيز صفيحة ميكروية ذات 96 بئراً للذباب.

املأ كل بئر بطبقتين من الغذاء. ابدأ بالوسط، حيث يتم إضافة 300 µL من محلول sucrose بتركيز 5% وagar بتركيز 2% إلى كل بئر. غطِّ الطبق بقطعة قماش من الشبكة الناعمة واترك الطبق ليجف تماماً لمدة تصل إلى ساعة واحدة.

بعد ذلك، أضف طبقة علوية بحجم 50 µL إلى كل بئر تحتوي على 5% sucrose و1% agar و2 mM Lucifer. ونظراً لأن Lucifer حساس للضوء، اترك الطبق ليجف في الظلام، واعمل على تقليل تعريض الطبق للضوء في الخطوات التالية.

بمجرد أن يبرد الآجار، غطِّ الطبق بفيلم لاصق شفاف. ثم باستخدام إبرة دقيقة، اثقب الفيلم مرتين فوق كل بئر. تسمح هذه الثقوب بتبادل الهواء والتخدير الغازي.

بعد ذلك، ولتسهيل تحميل الذباب، استخدم شفرة حادة ومسطرة لإحداث قطع بين كل عمود. قم بتخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون وحمّله واحداً تلو الآخر في كل بئر عموداً تلو الآخر. في حال التصاق ذبابة بالغشاء، امنحها فرصة لتحرير نفسها قبل التدخل.

أعد طبق الآبار الدقيقة إلى الحاضنة تحت إضاءة مستمرة لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة. ولتخدير الذباب الموجود في الآبار، استخدم رأس ماصة دقيقة متصل بخط ثاني أكسيد الكربون بضغط منخفض. تأكد من أن الغاز بضغط منخفض غير ضار، وضع رأس الماصة الدقيقة مباشرة فوق فتحات التهوية لتخدير الذباب في مجموعات من ثمانية بشكل فردي.

انقل كل ذبابة إلى وسادة CO2 وقم بإصابتها بالبكتيريا كما سبق. بعد ذلك، أعد كل ذبابة إلى بئرها الأصلي وأغلق الصفيحة الدقيقة مرة أخرى. قم بقياس التألق الحيوي في كل ذبابة باستخدام مقياس التألق الحيوي الموجود في غرفة مضبوطة درجة الحرارة وفقاً لجدول إضاءة محدد.

ضع الأطباق في كاسيت التكديس، مع التأكد من وضع الأطباق التي تحتوي على الذباب بين أطباق فارغة وشفافة. قم ببرمجة مقياس اللمعان (luminometer) وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة وجمع القراءات كل ساعة لمدة لا تقل عن 24 ساعة. في هذا المثال، تمت برمجة الكواشف لقراءة كل بئر لمدة 10 ثوانٍ.

بمجرد الانتهاء، قم بتصدير ملفات البيانات إلى جدول بيانات وإجراء تحليل قياسي لتمثيل النتائج بيانياً. يمكن تحليل البيانات النموذجية. تم حساب متوسط الخصومات لكل ثانية من ثلاث قراءات لكل بئر.

تم وضع ذباب من النوع البري Canton S وذباب طافر relish. E 20 يفتقر إلى جين NF kappa B في جهازي مراقبة النشاط تحت ضوء مستمر، ثم حُقنت بـ sia. في هذا المثال، أدى الالتهاب إلى تحفيز النوم.

كان من الواضح أن طفرات relish E 20 قد شهدت فترة نوم أقل من ذباب Canton s الضابط بعد العدوى. واتساقاً مع النتائج السابقة، فقد نفقت طفرات relish E 20 أيضاً بسرعة نتيجة العدوى مقارنة بذباب النوع البري.

نجت معظم الذباب من حقن المجموعة الضابطة المعقمة، مما يشير إلى أن الذباب قد نفق بسبب العدوى وليس بسبب الإصابة الناتجة عن الحقن. ونظراً لأن طفرات relish نفقت بسرعة كبيرة، فقد استُخدم ذباب Canton s فقط لتوضيح الحمل البكتيري بعد العدوى. واستمرت Sia في التكاثر داخل الذباب بعد 24 ساعة من العدوى.

أظهر نشاط مراسل لوسيفير تبايناً كبيراً بين الذباب الفردي وبين نقاط البيانات المتتالية. ورغم أن الإشارة مشتقة من جميع أنسجة الذبابة، فمن غير المتوقع أن تبعث كل الأنسجة نفس القدر من الإشارة، كما أن وضوح رؤية النسيج للكاشف قد يتفاوت مع حركة الذبابة. في هذا المثال، تم إصابة الذباب ومقارنتها بمجموعة ضابطة خضعت للمناولة.

تم استبعاد الذباب الذي نفق من التحليل الذي أُجري على مجموعة من الذباب. يرتفع نشاط مراسل لوسيفيراز Kappa b بشكل مستمر بعد الإصابة. كما ارتفع نشاط مراسل لوسيفيراز Kappa b بشكل مستمر بعد الإصابة العقيم.

كانت ذروة النشاط عند حوالي 12 ساعة لكل من مرحلتي ما بعد الإصابة وما بعد العدوى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الوظيفة المناعية والنوم في SSO بعد العدوى. يمكننا قياس النوم، والبقاء على قيد الحياة، والوقت، والتخلص من البكتيريا، والنشاط في الوقت الحقيقي لمراسل نسخ غير منسوخ.