تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel

يهدف هذا الإجراء إلى التطبيق الأيوني لـ pharmacological agents على الدوائر الدقيقة في الدماغ مع تسجيل النشاط العصبي في آن واحد. أولاً، يتم سحب قطب كهربائي زجاجي أحادي الأنبوب لتسجيل خلية واحدة وثني طرفه. كما يتم سحب قطب كهربائي زجاجي متعدد الأنابيب وكسر طرفه للوصول إلى القطر المطلوب.

باشر بتجميع القطبين الكهربائيين. وفي النهاية، يُستخدم القطب الناتج لإجراء تسجيلات خارج خلوية في الجسم الحي، حيث يمكن تطبيق عوامل دوائية عند الطلب للتلاعب بالدوائر العصبية الدقيقة. مرحباً، اسمي د. Achim Klu، وسيوضح لكم مختبرنا اليوم كيفية إنتاج أقطاب متعددة الأسطوانات بنظام piggyback.

يمكن استخدام هذه الأقطاب الكهربائية لإدخال ناهضات ومضادات الأعصاب عبر حاملات الأيونات (ionophores) إلى البيئة الدقيقة للعصبون، وبالتالي التحكم في الدوائر العصبية للعصبون في الجسم الحي. مرحباً، أنا الدكتورة أن زيلو، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور أهيم كرو، وسأقوم بشرح الإجراء اليوم. بالنسبة للقطب الكهربائي أحادي الفوهة، استخدم شعيرة زجاجية أحادية الفوهة مع فتيلة، واسحب الطرف ليصل قطره إلى حوالي 1-2 µm وطول الساق من 10-12 mm.

تحقق من مقاومة القطب المسحوب بشكل متقطع عن طريق ملئه بـ sodium chloride بتركيز ثلاثة مولار واختباره باستخدام مقياس O قياسي في محلول ملحي بتركيز 0.9%. بمجرد ملء القطب بالمحلول الملحي، يجف المحلول بسرعة، مما يجعل القطب غير صالح للاستخدام. لذا، قم بإجراء هذا الاختبار فقط.

قم بسحب بعض الأقطاب الكهربائية التي لن تُستخدم في إنتاج القطب الملحق (piggyback). ولإنشاء قطب كهربائي كامل متعدد الفوهات، اسحب الزجاج حتى تصل فوهة الماصة إلى قطر إجمالي يبلغ حوالي 10 micrometers أو أقل. إن الحصول على قطب كهربائي بفوهة مسحوبة بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية لنجاح العملية.

بالإضافة إلى كون الطرف طويلًا ونحيفًا، يجب أن يظل متماسكًا وقابلًا للكسر بسهولة للوصول إلى قطر الطرف المطلوب. سيتم كسر الطرف للوصول إلى القطر الصحيح في الخطوة التالية. لذا، فإن الحجم الدقيق للطرف أقل أهمية أثناء عملية التجميع من الشكل العام لطرف القطب، والذي يجب أن يكون طويلًا ونحيفًا نسبيًا.

الآن، أمسك القطب أحادي الفوهة بزاوية 45 درجة تقريبًا، بحيث يشير الطرف إلى الأسفل، وحركه عبر اللهب بسرعة نسبية. احرص على أن يقوم اللهب بصهر الزجاج في منطقة الانتقال على بُعد 10 مليمترات تقريبًا من طرف القطب لثنيه بزاوية 20 درجة تقريبًا. ضع القطب متعدد الفوهات في طبقة من صلصال النمذجة على شريحة زجاجية، ثم أدخله في منصات المجهر.

حامل الشرائح باستخدام أدوات التحكم XY في منصة المجهر، حرك طرف القطب الكهربائي برفق باتجاه قطعة البلكسي جلاس. راقب كسر الطرف من خلال عدسات المجهر العينية. يظهر هنا إعداد تجميع القطب الكهربائي.

يُثبت القطب الكهربائي متعدد الفوهات على شريحة زجاجية فوق طاولة المجهر. بينما يُثبت القطب الكهربائي أحادي الفوهة بواسطة مناول يدوي متعدد المحاور يتيح للمستخدم خفض الماصة أحادية الفوهة فوق الماصة متعددة الفوهات بدقة عالية. اخفض القطب الكهربائي أحادي الفوهة مباشرة في التجويف الموجود في القطب الكهربائي متعدد الفوهات، والذي يتشكل بفعل ترتيب الفوهات الخمس، بحيث يبرز طرفه عن طرف القطب متعدد الفوهات بمقدار 5 إلى 10 micrometers تقريباً.

قم بلصق أعمدة القطبين الكهربائيين معاً باستخدام السيانوأكريليت. ابدأ من الموضع الأكثر بعداً عن الأطراف، وحرك عود أسنان عليه قطرة من الغراء ببطء على طول أعمدة الأقطاب الكهربائية باتجاه الأطراف. إن وضع الغراء بالقرب من أطراف الأقطاب الكهربائية سيؤدي إلى سدها ويجعل القطب غير فعال جزئياً على الأقل.

اخلط كمية صغيرة من الإسمنت السني. اتركها لمدة 15 دقيقة تقريباً لتجف. ثم قم بإزالة القطب الكهربائي الملحق (piggyback electrode) المكتمل بعناية.

أولاً من حامل الميكرو-مانيبوليتور (المُحرك الدقيق)، ثم افصله عن الشريحة الزجاجية. وقبل استخدام القطب الكهربائي مباشرةً، استعد لملء كل أنبوب بالدواء الخاص به من الخلف. املأ الأنابيب الأربعة الخارجية في تكوين الأنابيب الخمسة بأربعة أدوية مختارة، والأنبوب المركزي بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 3 molar ليكون بمثابة أنبوب موازنة.

ثم املأ قطب التسجيل أحادي الفوهة بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 3 molar. الآن، قم بتشغيل وحدات مضخة الرحلان الأيوني واختبر جميع الفوهات. ستساعد وظيفة اختبار القطب في كل وحدة مضخة في تحديد ما إذا كانت فوهة القطب صالحة للتسجيلات العميقة في الدماغ.

يتكون القطب الكهربائي المكون من خمسة براميل والمجمع مع قطب تسجيل أحادي البرميل من ساق طويلة تبلغ حوالي seven millimeters. تُستخدم عدة مواد محفزة ومثبطة للمشابك العصبية بشكل شائع مع عملية الإدخال الأيوني، حيث يتم حظر تثبيط الجلايسين باستخدام أدوية مثل مضادات مستقبلات الجلايسين. وعادةً ما يؤدي Trick nine hydrochloride إلى زيادة معدل الإطلاق في العصبونات.

تقيس بيانات هذه العينة دالة معدل تفريغ العصبونات السمعية مقابل الشدة، وتُظهر الاستجابات لمحفزات صوتية جيبية ذات شدة متزايدة تم تقديمها إلى أذني الحيوان. أدت الأصوات الأعلى إلى معدلات تشبيك (spike rates) أعلى قبل تطبيق المعيار الصارم تسعة. وتُظهر دالة شدة معدل العصبونات معدلات تشبيك منخفضة.

يؤدي تطبيق تيار أيونوفوريزي أولي بقيمة 15 nano amps إلى تحفيز زيادة طفيفة في تيار الطرد. وتعمل تيارات الطرد الأعلى تدريجياً على حصر المزيد من مستقبلات الجلايسين في العصبون، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات التنشيط تدريجياً. وعند تيار بقيمة 45 nano amps، يبدو أن جميع مستقبلات الجلايسين في ذلك العصبون قد تم حصرها بواسطة strict nine hydrochloride.

لم تؤدِ أي زيادة إضافية في تيار القذف وإطلاق كميات أكبر من العقار إلى حدوث تغيير إضافي. وفيما يتعلق بدالة مستوى معدل تفريغ العصبونات بعد إنهاء عملية الإدخال الأيوني، فإن الاستعادة الكاملة للاستجابات العصبية إلى المستوى المرجعي تحدث بعد حوالي 25 دقيقة. وتعتمد عملية الاستعادة هذه على نوع وكمية العقار المقذوف.

من المهم تذكر أن العقار سيتسرب إلى المنطقة المجاورة لموقع التسجيل وقد يحجب أيضاً المستقبلات في العصبونات المجاورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين قطب التسجيل وقطب عقاري متعدد الفوهات للحصول على تسجيلات من الدماغ العميق ذات ضوضاء منخفضة، جنباً إلى جنب مع التحكم الزمني في إيصال ما يصل إلى أربعة عوامل فارماكولوجية.