باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنفيذ تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد كمية نقش الخلايا المانحة في نموذج تنافسي لزرع نخاع عظم الفئران ، ويتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء عملية زرع نخاع العظم أولا في الفئران المتلقية الإناث باستخدام خلايا متبرعة من الذكور. بعد ذلك ، يتم جمع الدم المحيطي من الفئران المتلقية في نقاط زمنية مختلفة ويتم عزل الحمض النووي الجيني. يتم تحضير العينات لمنحنى قياسي.

أخيرا ، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام عينات قياسية وعينات اختبار. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر نقش الخلايا المشتقة من المتبرع الذكور في إناث الفئران المتلقية من خلال الحساب مقابل منحنى قياسي مع نسبة مئوية معروفة من الحمض النووي للذكور مقابل الإناث. الميزة الذكرية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل الطريقة القائمة على قياس التدفق الخلوي ، هي أنها أكثر حساسية وأكثر اقتصادية ويمكن تخزين العينات لفترة طويلة.

الأهم من ذلك ، أن تقنيتنا مستقلة عن الخيوط ويمكن استخدامها لأي خلفية جينومية للفئران مثل علامة سطح الخلية المحددة جيدا للتمييز بين الخلية المانحة والخلايا المتلقية بعد القتل الرحيم FVB nj ، تستخدم الفئران المانحة والإناث الذكور تحت غطاء التدفق الرقائقي مقصا صغيرا وملقطا لتشريح عظم الفخذ وعظام الساق ووضعها في طبق زراعة أنسجة 60 ملم يحتوي على ستة ملليلتر من البرد المثلج RPMI 1640 مع 5٪ حرارة غير نشطة. تستخدم FBS مناديل Kim لإزالة العضلات والأنسجة الأخرى وقطع طرفي كل عمود عظمي في الطبق. ثم قم بتوصيل نهاية العظام بإبرة قياس 23 متصلة بحقنة ثلاثية السن مكعب مملوءة ب RPMI 1640 مع 5٪ FBS معطل للحرارة وطرد النخاع.

استخدم نفس الإبرة لتفكيك أنسجة نخاع العظم عن طريق الشفطات المتكررة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر وقم بتدويره لمدة خمس دقائق عند 400 جم ، بعد إزالة السوبر ، أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة ، وتحلل خلايا الدم الحمراء ، والمخزن المؤقت ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل إضافة خمسة إلى 10 ملليلتر من RPMI 1640 مع 5٪ FBS معطل للحرارة ، قم بتمرير الخلايا عبر مصفاة خلية وجمع التدفق من خلال مصفاة خلية جديدة أنبوب. بعد تدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 جم وإزالة المادة الطافية ، يجب أن تكون الحبيبات غائبة عن اللون الأحمر مما يشير إلى الإزالة الكاملة لخلايا الدم الحمراء المعلقة في 10 ملليلتر من RPMI 1640 مع 5٪ FBS معطل بالحرارة بعد الدوامة برفق ، أضف كمية صغيرة إلى مقياس الخلوي الدموي وعد الخلايا.

احسب حجم الخلايا المطلوبة للاختلاط مع الخلايا الأنثوية المنافسة بنسبة خمسة إلى اثنين لزراعة نخاع العظم. كخطوة أخيرة لإعداد الخلايا للحقن ، قم بخلط الخلايا المانحة والمنافسة ، وقم بغسل الخلايا باستخدام PBS وإعادة تعليقها في PBS بتركيز نهائي من خمسة أضعاف 10 إلى السادس لكل مليلتر من الخلايا المانحة ومرتين 10 إلى السادس لكل مليلتر للخلايا المنافسة ، قبل أربع إلى ست ساعات من زرع نخاع العظم. تشعيع إناث الفئران المتلقية بإشعاع السيزيوم 1 37 جاما بجرعة واحدة من 11 رمادي.

ضع إناث الفئران المشععة في مصفاة الفأر وحقن الخلايا المختلطة المانحة والمنافسة عبر وريد الذيل في حجم إجمالي يبلغ 0.1 مليلتر بحيث يتلقى كل فأر خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا المانحة الخامسة ومرتين 10 إلى خلايا نخاع العظم الخامسة المنافسة لسحب عينات الدم. بعد التخدير ، تجمع الفئران حوالي 50 ميكرولترا من الدم في أنابيب مغلفة ب EDTA عن طريق النزيف خلف الحجاج. اجمع أيضا عينات من الفئران من الذكور والإناث المتطابقة مع العمر.

بجانب عزل الحمض النووي الجيني من الفئران والفئران المعنية. بالنسبة للمنحنى القياسي ، أضف حوالي 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء بدرجة حرارة الغرفة إلى كل عينة دم واحتضنه لمدة خمس دقائق. أضف ملليلترا واحدا من PBS وقم بتدويرها لإزالة معظم كرات الدم الحمراء المحللة.

ثم استخدم مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي في الدم لعزل الحمض النووي قبل تسخين المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية. لتعزيز العائد ، قم بقياس تركيز الحمض النووي لكل عينة. وتستخدم تلك التي لها نسبة OD اثنين 60 إلى اثنين 80 بين 1.8 إلى 2.0 لمزيد من التحليل.

لإنشاء منحنى قياسي ، قم بتخفيف الحمض النووي للذكور والإناث إلى تركيز أربعة نانوجرام لكل ميكرولتر وقم بإعداد خليط الحمض النووي وفقا لهذه الإرشادات. قم بإعداد لوحة تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق خلط كاشف المزيج الفائق باللون الأخضر الإلكتروني مع البادئات الموضحة هنا والحمض النووي الجيني. يحتوي كل تفاعل 20 ميكرولتر على 400 نانو مولار من كل برايمر وخمسة ميكرولترات من الحمض النووي الجيني لخلايا الدم التي يتم تشغيلها في ثلاث نسخ.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للشروط الموجودة في بروتوكول النص واحصل على عتبة الدورة أو قيم التصوير المقطعي المحوسب. احسب دلتا CT مضروبا في الكمية CT إلى قوة ZY واحد ناقص CT أس قوة BCL اثنين و ZY مستوى تعبير واحد أو اثنان إلى قوة ناقص دلتا CT تولد منحنيات قياسية عن طريق رسم متوسط ثلاثي النسخ اثنين إلى قوة قيم دلتا CT إلى النسبة المئوية المعروفة للحمض النووي الذكري في الخليط مع تركيب الانحدار الخطي الموضح. فيما يلي أمثلة على المنحنيات القياسية المرسومة بقيم متوسطة قدرها اثنين لقوة دلتا المقطعي المحوسب مقابل النسب المئوية للحمض النووي الذكري.

تتضمن هذه القطعة درجة حرارة انصهار محددة ل BCL two و ZFY one amplicons موضعية عند 78.5 و 88.5 درجة مئوية على التوالي. يستخدم BCL two كجين مرجعي لتطبيع الكمية الإجمالية للحمض النووي المحمل في كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يندمج منحنيان تضخيم BCL لكل عينة قياسية مع بعضهما البعض بغض النظر عن تركيز الحمض النووي الذكري مما يشير إلى كميات متساوية من الحمض النووي المحمل.

ومع ذلك ، فإن منحنيات تضخيم ZFY واحدة هاجرت إلى اليسار مع زيادة كميات الحمض النووي الذكرية في عينة الخلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران PIM TKO لديها عيوب في إعادة تكوين الفئران المعرضة للإشعاع المميت ، وكما هو متوقع ، كان لدى الفئران المتلقية المزروعة بخلايا PIM TKO نسبة أقل بكثير من الخلايا الذكرية مقارنة بالفئران المزروعة بخلايا من النوع البري. للتحقق من صحة طريقتنا ، اختبرنا نقش خلايا المتبرع الذكري في إناث الفئران المزروعة ، وتلقي خلايا نخاع العظم من النوع البري مقابل الفئران بالضربة القاضية الثلاثية PIM أو TKO في نقاط زمنية مختلفة بعد الزرع ، سواء الدم المحيطي في ستة أسابيع وعينات نخاع العظم في 16 أسبوعا. تم تحليلها بعد مشاهدة هذا الفيديو.

يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الطريقة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد نقش الخلايا المانحة في نموذج تنافسي لزرع نخاع العظم البحري.