التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

الهدف العام من التجربة الموضحة في هذا الفيديو هو تقييم ما إذا كان الببتيد المضاد للميكروبات lyin يلعب دوراً في تخفيف حدة التهاب القولون الناجم عن دكستران كبريتات في الفئران. ويتحقق ذلك عن طريق حقن نخاع عظمي من فئران من النوع البري في فئران مُشععة من النوع البري وفئران معطلة جينياً، ونخاع عظمي من فئران معطلة جينياً في فئران مُشععة من النوع البري. وسيقوم النخاع العظمي المزروع بتوليد خلايا دم جديدة في المستقبل من النمط الجيني للمانح.

يتم بعد ذلك تعريض الفئران المستقبلة لديكستران سلفات لتحفيز التهاب القولون بعد أربعة أسابيع. ويتم التحقق من نجاح عملية الزرع عن طريق قياس التدفق الخلوي، بينما يتم تقييم تلف أنسجة القولون عن طريق الفحص النسيجي. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن التهاب القولون قد تحسن عند زرع نخاع عظم من النوع البري في الفئران التي تعاني من تعطيل جيني.

وعلى العكس من ذلك، تزداد حالة التهاب القولون سوءاً عند زرع نخاع عظمي مستأصل الجينات في فئران من النوع البري. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية لتحديد التعبيرات الجينية للخلايا المشتقة من نخاع العظم أو الخلايا غير المشتقة من نخاع العظم في حالات الالتهاب أو العدوى. ويُنصح باستخدام فئران C 57, black six من النوع البري وفئران C التي تعاني من استئصال الجينات في هذه التجربة، وذلك لإمكانية تتبع الفئران من النوع البري والفئران المستأصلة الجينات.

خلايا المانح بعد عملية زراعة نخاع العظم. يتم استخدام فئران CD 45.1 لتمثيل الفئران البرية (wild type) وفئران CD 45.2 للفئران المعطلة جينياً (knockout). يوضح المخطط المعروض هنا الإعداد التجريبي، حيث تم تخصيص خمسة فئران مانحة و10 فئران مستقبلة لكل مجموعة.

بالنسبة للمجموعتين A و B، سيتم نقل نخاع العظم من الفئران من النوع البري (wild type) إلى الفئران التي تعاني من تعطل جيني (knockout). سيتم تحفيز التهاب القولون في المجموعة A، وليس في المجموعة B. بالنسبة للمجموعتين C و D، سيتم نقل نخاع العظم من الفئران التي تعاني من تعطل جيني إلى الفئران من النوع البري، وسيتم تحفيز التهاب القولون في المجموعة C فقط. أما بالنسبة للمجموعتين E و F، فسيكون النقل من النوع البري إلى النوع البري، وبالنسبة للمجموعتين G و H، سيكون النقل من الفئران ذات التعطل الجيني إلى الفئران ذات التعطل الجيني. لتحضير نخاع العظم المانح لنقله إلى الفئران المعرضة للإشعاع، ابدأ باستخراج نخاع العظم من عظام الفئران التي تم التضحية بها داخل كابينة السلامة البيولوجية.

استخدم أدوات تشريح معقمة للكشف عن عظام العضد والفخذ والقصبة والشظية، مع تحريرها من العضلات والأربطة المتصلة بها، ثم انقلها إلى طبق بتري. اقطع طرفي العظام لإظهار نخاع العظام الأحمر. بعد ذلك، أمسك بإحدى العظام باستخدام الملقط.

قم بغسل نخاع العظم الأحمر باستخدام محلول PBS بارد بواسطة سرنجة سعة ثلاثة ملليلتر وإبر عيار 25 في طبق بتري آخر. ثم اغسل العظم من الطرف الآخر للحصول على المزيد من خلايا نخاع العظم. كرر هذه العملية مع كل عظمة.

اجمع نخاع العظم من الفئران من النوع البري (wild type) والفئران التي تم تعطيل الجينات فيها (knock out) بشكل منفصل. استخدم حقنة سعة 6 mL مع إبرة مقاس 18 gauge وبطول 0.5 inch لتفتيت سدادات نخاع العظم الأحمر عن طريق تكرار عمليات السحب والدفع. بعد ذلك، استخدم ماصة سيرولوجية لنقل نخاع العظم الذي تم جمعه إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

بمجرد نقل جميع نخاع العظم، يتم إجراء طرد مركزي لنخاع العظم عند 740 G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد عملية الطرد المركزي، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب عن طريق الرج الميكانيكي (vortexing) لمدة تتراوح من خمس إلى 10 ثوانٍ. يُضاف إلى الراسب خمسة ملليلتر من محلول XRBC lysis buffer لكل فأر مانح، ثم يتم الرج الميكانيكي مرة أخرى لمدة خمس ثوانٍ والتحضين لمدة ثلاث دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور ثلاث دقائق، أضف 20 milliliters من PBS البارد إلى كل أنبوب واخلط عن طريق القلب لإيقاف عملية التحلل. ثم اسكب المحتويات عبر مصفاة خلايا بمسام 40 micron في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliters. اشطف الأنبوب الأصلي باستخدام خمسة milliliters من PBS وانقل المحلول إلى مصفاة الخلايا.

الاستمرار في تجميع السائل المار في الأنبوب المخروطي. بعد ذلك، يتم استكمال الحجم إلى 50 milliliters باستخدام PBS والمزج عن طريق القلب. بعد ذلك، يتم تحديد عدد الخلايا الحية عن طريق استبعاد tripan blue باستخدام hemo cytometer.

بمجرد تحديد عدد الخلايا، قم بطرد خلايا نخاع العظم مركزياً عند 913 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي بناءً على العدد الإجمالي للخلايا. أعد تعليق الراسب في PBS بتركيز 1 × 10⁸ خلايا/ملليلتر.

أصبحت خلايا نخاع العظم الآن جاهزة للنقل إلى الفئران المستقبلة التي تعرضت للإشعاع. لقد تم تعريض الفئران المستقبلة من النوع البري وفئران التعطيل الجيني (knockout) في هذه التجربة لإشعاع بمقدار 1000 rad كما هو موضح في المستند المرفق، ويتم تربية هذه الفئران وإيواؤها في منشأة خالية من الممرضات؛ وبعد مرور أربع إلى 24 ساعة من التعرض للإشعاع، يتم تدفئة الفئران المستقبلة على وسادة تدفئة تحت مصباح تدفئة قبل حقن نخاع العظم المانح. ضع فأراً مستقبلاً في أداة التقييد، وامسح الذيل بـ 70% ethanol لتعقيم موقع الحقن وتعزيز تمدد الأوعية الدموية الموضعي لتسهيل عملية الحقن.

باستخدام حقنة إنسولين ذات إبرة بمقياس 28.5، احقن 1 × 10⁷ خلية في 1 إلى 200 µL في الوريد الذيلي لكل فأر. ضع الفأر في قفص مع ما يصل إلى ثلاثة فئران أخرى محقونة خلال الأسابيع الأربعة الأولى بعد الحقن. يتم الحفاظ على الفئران المستقبلة المحقونة في أقفاص معقمة بجهاز الأوتوكليف مع توفير مياه تحتوي على المضاد الحيوي sulfa trim.

يتيح ذلك وقتاً للحيوانات لاستعادة المناعة، مع تغيير الأقفاص والماء والطعام المعالج بالمضادات الحيوية كل أربعة أيام للحفاظ على النظافة. وبعد أربعة أسابيع من التشعيع وزراعة نخاع العظم، يتم الانتقال إلى الماء العادي الخالي من المضادات الحيوية والاحتفاظ بالفئران لمدة أسبوعين إضافيين لاستعادة الفلورا المعوية الطبيعية. وبعد ستة أسابيع من حقن نخاع العظم، يتم قياس وزن الجسم الأولي لتحفيز التهاب القولون.

قم بإعطاء الفئران في مجموعة تجربة التهاب القولون 5% dextran sulfate في مياه الشرب. وبعد خمسة أيام، اجمع الدم المحيطي من أربعة فئران في أنابيب vacutainer مطلية بالهيبارين وضعها على الثلج. بعد ذلك، وفي أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، امزج 300 µL من الدم مع 300 µL من محلول صبغة الخلايا المنظم، ووزع الدم على خمسة أنابيب اختبار خاصة بتدفق السيتومتري مرقمة من واحد إلى خمسة، بحيث يحتوي كل أنبوب على 100 µL على الثلج.

بعد التضحية بالفئران، قم بقياس وزن الجسم مرة أخرى واحسب مقدار التغير. قم بتشريح أنسجة القولون ووضعها في الفورمالين من أجل صبغتي h و d. ثم استخلص خلايا نخاع العظم كما سبق.

قسّم نخاع العظم المعاد تعليقه إلى خمسة أنابيب طرد مركزي دقيق مرقمة من واحد إلى خمسة، بحيث يحتوي كل أنبوب على 100 milliliters. وتحضيراً للتحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي، قم بتجهيز خليط الأجسام المضادة لكل أنبوب على حدة في الظلام كما هو موضح في المستند المرفق؛ حيث ستعمل عينات الدم ونخاع العظم المرقمة بالرقم واحد كعناصر تحكم ولن يتم صبغها، بينما سيتم صبغ عينات الدم ونخاع العظم المرقمة بالرقم اثنين باستخدام fitzy isotype control و PE isotype control ومحلول حجب CD 16/32.

تُستخدم ضوابط النمط المتماثل هذه لتأكيد خصوصية ارتباط الأجسام المضادة الأولية بالعينات. سيتم صبغ العينة رقم ثلاثة باستخدام FZ CD 45.1 و CD 16/32. أما عينات محلول الحجب التي تحمل الرقم أربعة، فسيتم صبغها باستخدام CD 45.2 و CD 16/32.

محلول الحجب. يمكن أن يكشف الوسم بلون واحد عن وجود الخلايا المانحة أو المستقبلة في الدم أو نخاع العظم. ومن الواضح أن العينات المرقومة بالرقم خمسة سيتم صبغها لـ CD 45.1 و CD 45.2 و CD 16/32.

يوضح وسم اللون المزدوج هنا النسبة النسبية للخلايا المانحة والمتلقية في الدم أو نخاع العظم. أضف 5 µL من خليط الأجسام المضادة 2 و5 إلى أنابيب العينات الخاصة بها. ثم أضف 3 µL من خليط الأجسام المضادة 3 و4 إلى أنابيب العينات الخاصة بها.

تُحضن جميع الأنابيب على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد التحضين، يُضاف 2 mL من XRBC lysis buffer إلى كل أنبوب. ثم تُحضن العينات لمدة 15 دقيقة إضافية على الثلج في الظلام.

قم بمركزة الخلايا عند 350 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية المركزفة، تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب باستخدام 500 µL من محلول صبغ الخلايا المنظم في الظلام. ثم قم برج العينة بجهاز الفورتكس لفترة وجيزة.

بعد ذلك، قم بإجراء تحليل التدفق الخلوي (flow cytometry) على عينات الدم ونخاع العظم المصبوغة مناعيًا. اختر FZ لتمثيل النوع البري CD 45.1 و PE لتمثيل النوع المعطل CD 45.2. قم بتحليل نتائج التدفق الخلوي باستخدام برنامج Flo Joe.

احسب نسبة fit E إلى PE أو نسبة PE إلى fit e لتحديد ما إذا كان النمط الجيني للمانح هو النمط الجيني السائد في الدم ونخاع العظم. تُظهر هذه الصورة عينات من صور h و e للقولون مع أنسجة طبيعية والتهاب القولون الناجم عن DSS. يتم تقييم صور الأنسجة بناءً على تلف الأنسجة المخاطية وتسلل الخلايا المتعادلة إلى الأنسجة المخاطية وتحت المخاطية.

وبالتالي، تشير درجة التشريح المرضي الأعلى إلى التهاب قولون أكثر شدة، وذلك لاختبار ما إذا كان لبروتين lyin دور في الوقاية من التهاب القولون. تم استبدال نخاع العظم بين الفئران من النوع البري والفئران التي تعاني من تعطيل الجين (knockout) كما هو موضح في هذا الفيديو. ثم تم تقييم التشريح المرضي وتحديد الدرجة كما هو موضح هنا.

ارتفعت درجات الفحص النسيجي بشكل ملحوظ عند إدخال نخاع عظمي من فئران معطلة جينيًا (knockout) في فئران من النوع البري (wild type) معرضة للإشعاع. وعلى العكس من ذلك، انخفضت الدرجات بشكل ملحوظ عند إدخال نخاع عظمي من النوع البري في الفئران المعطلة جينيًا. وتشير هذه البيانات إلى أن البروتين C الداخلي المستمد من خلايا نخاع العظم له تأثيرات مضادة للالتهابات ويعمل على تحسين حالة التهاب القولون، وذلك للتحقق من نجاح عملية الزرع في هذه الفئران.

أُجري أيضاً تحليل التدفق الخلوي على نخاع العظم والدم من الفئران بعد عملية الزرع. تظهر صبغة نخاع العظم من النوع البري تفاعلاً قوياً مع Fitz CD 45.1 وليس pe, CD 45.2 كما هو موضح هنا، بينما تظهر صبغة نخاع العظم من الفئران المعطلة جينياً تفاعلاً قوياً مع PE وليس Fitz كما هو موضح هنا. ومع ذلك، بعد عملية الزرع، صبغ كل من نخاع العظم والدم من الفئران من النوع البري التي استقبلت نخاع عظم من فئران معطلة جينياً تفاعلاً قوياً مع PE وليس Fitz، مما يشير إلى أن المجموعة السائدة من الخلايا المصبوغة كانت من المتبرع.

وبالمثل، أظهر نخاع العظم والدم من الفئران التي خضعت لتعطيل الجينات (knockout) وتلقت نخاع عظم من النوع البري صبغة قوية لـ fitzy ولكن ليس لـ pe، مما يؤكد مجدداً أن المجموعات المصبوغة السائدة كانت من أصل المتبرع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على إجراء تجربة زراعة نخاع العظم وأن تكون قادراً على تعديل التهاب القولون عبر الخلايا المشتقة من نخاع العظم.