في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من القيطم العصبي العضلي المشارك الثقافات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على الثقافات الأولية للخلايا العصبية الشوكية المقترنة متشابكيا وخلايا العضلات من أجنة xenopus. يتم تحقيق ذلك عن طريق التكاثر أولا في xenopus عن طريق حقن المشيمية البشرية في الأتروبين في كل من الضفادع من الذكور والإناث وجمع البويضات المخصبة. الخطوة الثانية هي إزالة طبقة الهلام والفاتيل والأغشية من أجنة المرحلة 22.

بعد ذلك ، يتم عزل الخلايا العصبية والعضلات الشوكية عن الأجنة وإزالة الجلد والتخلص منه. الخطوة الأخيرة هي وضع الخلايا المعزولة في أطباق الاستزراع والسماح بتكوين تقاطعات عصبية عضلية وظيفية. في النهاية ، يمكن إثبات الوصلات المشبكية الوظيفية من خلال تسجيلات مشبك التصحيح المزدوجة المتزامنة من الخلايا العصبية وخلايا العضلات في الثقافة.

يكمن جمال هذه التقنية في أنها تنتج مستحضرا متشابك للفقاريات يمكن الوصول إليه بسهولة. يمكن استخدامه لمراقبة إطلاق الناقل العصبي من خلال تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية بعد المشبكي مع قياس حدوث الأيونات قبل المشبكي في نفس الوقت. علاوة على ذلك ، فإن الطرق واضحة ومباشرة ، ولا تتطلب أي معدات خاصة تتجاوز مجهر التشريح ، ويمكن بعد ذلك تخزين الثقافات في درجة حرارة الغرفة في وسط زراعة بسيط.

يمكن أن يكون هذا التحضير مفيدا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم وظائف الأعضاء المشبكي ، بما في ذلك كيفية اقتران الأحداث قبل التشابك والكيميائي الحيوي والفيزيائية الحيوية بإطلاق الناقل العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، من المفيد أيضا دراسة تكوين التسلسل العصبي واللدونة المشبكية لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد الحلول المطلوبة وفقا للمخطوطة المصاحبة. ثم قم بتصنيع أداتين على الأقل للتشريح الدقيق عن طريق لصق دبوس مينوشين في نهاية ماصة زجاجية باستير.

باستخدام غراء الأكريليك سانو ، اسمح للطرف الحاد للدبوس بالتمدد بعد نهاية الماصة حوالي 0.5 سم. قبل يومين من تحضير الثقافات ، حدد زوجا جاهزا للتكاثر من XUS من خلال ملاحظة مخلب محمر بارز أيكا على الأنثى والتصبغ الداكن على السطح المستوي للمخالب الأمامية للذكر. بعد ذلك ، قم بشبكة كل ضفدع واحتفظ به من جانبه البطني لأسفل في حوض بالشبكة حتى يتمكن من الهروب.

حقن مليلتر واحد من قوات حرس السواحل الهايتية من خلال الشبكة وتحت الجلد في أحد الأكياس الليمفاوية الظهرية للتأكد من أن لن تدوس البويضات الموضوعة حديثا والمخصبة. قم بتثبيت أرضية محجوبة بحجم شبكي يبلغ نصف بوصة مثبتة من بوصة إلى بوصتين في الجزء السفلي من الخزان. ثم ضع زوج التكاثر معا في خزان ماء مغطى سعة 10 جالون.

اترك الضفادع دون إزعاج لمدة 12 إلى 48 ساعة حتى يتم ملاحظة البويضات المخصبة على الأرض أسفل الشاشة. ثم أخرج من الخزان ، لكن اترك البيض دون إزعاج لمدة 24 ساعة على الأقل. يمكن إعادة تربية هذا الزوج من الضفادع بعد ستة أسابيع.

بعد ذلك ، قم بفك الأجنة من قاع الخزان وانقلها إلى أربعة أو خمسة أطباق استزراع 60 × 15 ملم تحتوي على 10٪ محلول ملحي. قم بفرز الأجنة حسب المرحلة وفقا لمخطط أجنة الكوبيه و Faber الجديدة ذات المظهر الناعم مع النمذجة الفاتحة والبني والأبيض مثل تلك الموجودة على اليسار مثالية. من ناحية أخرى ، فإن الأجنة التي تحتوي على بقع سوداء أو بيضاء كبيرة مثل تلك الموجودة على اليمين تكون بشكل عام غير صحية وغير صالحة للاستعمال.

داخل ملصق غطاء التدفق الصفحي واملأ أطباق الثقافة المعقمة بحجم 360 × 15 ملم تقريبا بمحلول ملحي بنسبة 10٪ وواحد بعامل CMF. باستخدام ماصة معجنة زجاجية معقمة ، قم بنقل خمسة إلى 10 ، المرحلة 22 إلى 24 أجنة إلى أحد الأطباق التي تحتوي على محلول ملحي بنسبة 10٪ مع ثمانية من مجهر تشريح تكبير ستيريو داخل الغطاء ، قم بإزالة طبقة الهلام والغشاء من كل جنين باستخدام زوجين من الملقط المعقم. اغسل الأجنة العارية عن طريق تمريرها واحدة تلو الأخرى عبر الطبقين المتبقيين من محلول ملحي بنسبة 10٪ ، وأخيرا في الطبق الذي يحتوي على CMF.

بعد ذلك ، أمسك كل جنين برفق ولكن بقوة باستخدام زوج من الملقط واستخدم أداة التشريح الدقيق لإزالة الأنبوب العصبي والعضلات العضلية المرتبطة بها ، والتي تقع في الجانب الظهري للحيوان. افعل ذلك عن طريق عمل ثلاث شرائح ، واحدة في أي من طرفي موقع الأنبوب العصبي والثالثة بطنية له. ثم انقل كل عضل عضلي للأنبوب العصبي المفصول إلى جزء نظيف من الطبق بعيدا عن حبيبات الصفار وغيرها من الحطام.

بعد حوالي 15 دقيقة في CMF ، استخدم الملقط لرفع الجلد المصطبغ خاليا من الأنسجة المقطوعة والتخلص من الجلد. بعد 30 إلى 60 دقيقة إضافية ، ستشكل الخلايا كومة رملية عندما تنفصل عن بعضها البعض. في هذا الإجراء ، قم بإذابة أنبوب 10 مليلتر من وسط الاستزراع ، بعد ذلك عند 70 ميكرولترا من ITS في 35 نانوغراما لكل مليلتر ، ملصق BDNF واملأ أطباق الثقافة المعقمة مقاس 35 ملم في منتصف الطريق تقريبا بوسط ثقافة L 15.

استخدم طبقا واحدا للثقافة لكل جنين قمت بتشريحه. لتصنيع ماصة الطلاء، أمسك طرفي ماصة زجاجية وضع الجزء المدبب فوق اللهب. ثم اسحب الأطراف بعيدا عن بعضها البعض إلى حوالي 10 سم.

بعد ذلك قطع النهاية لتسليم طرف حوالي 0.2 ملم. بعد ذلك ، استخدم ماصة الطلاء لامتصاص كومة الرمل من جنين واحد. احرص على تقليل كمية المحلول المسحوب.

بعد ذلك ، طرد الخلايا في قاع طبق الاستزراع وقم بوضعها في عدة أسطر. ثم اترك أطباق الخلايا المطلية دون إزعاج لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا بالوقت للالتصاق بالطبق. بعد 12 إلى 24 ساعة في الثقافة ، ستطور الخلايا المطلية خصائص مورفولوجية مميزة.

على سبيل المثال ، تصبح خلايا العضلات على شكل مغزل وتطور الخلايا العصبية الشوكية عمليات طويلة. يمكن تأكيد الاتصال المشبكي الوظيفي بين اليورات والدوالي وخلايا العضلات من خلال التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية المزدوجة المتزامنة. للقيام بذلك ، قم بإعداد قطبين للتسجيل ، أحدهما للدوالي قبل المشبكية ، والآخر للخلية العضلية.

ثم املأ القطب قبل المشبكي بمحلول يحتوي على معلومات terin والقطب الكهربائي بعد التشابك بمحلول داخلي للبوتاسيوم. بعد ذلك ، استبدل الوسائط في طبق الثقافة ب NFR. ثم انقله إلى مجهر مقلوب مزود بصريات تباين الوجه ، وقم بتصحيح الدوالي قبل المشبكي باستخدام القطب الكهربائي المحتوي على الأمفوتريسين وخلية العضلات بعد التشابك مع القطب الآخر لتأكيد وظيفة المشبك ، وإزالة الاستقطاب من الدوالي باستخدام مضخم مشبك التصحيح ، ومراقبة التيارات المتزامنة قبل المشبكي وما بعد المشبكي.

يوضح هذا الشكل عرض قوة خمسة x للخلايا والثقافة مباشرة بعد الطلاء ، وهذه هي نفس الثقافة عند 40 ×. فيما يلي الوصلة العصبية العضلية في الثقافة ، والتي تظهر الوسوم العصبي ، وقبل المشبكي ، والدوالي ، والخلية العضلية بعد المشبكي. تظهر هنا التيارات قبل المشبكية وما بعد المشبكي.

استجابة لتطبيق خطوات الجهد الإضافي 10 مللي فولت المقدمة إلى الدوالي قبل المشبكية من 30 مللي فولت تحت الصفر إلى زائد 40 مللي فولت ، كانت إمكانية الاحتفاظ لكلتا الخليتين سالب 70 مللي فولت بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي ساعتين. يمكن بعد ذلك الحصول على مزارع الخلايا القابلة للحياة في أقرب وقت ممكن 24 ساعة ويمكن الحفاظ عليها لعدة أيام. تم استخدام هذا المستحضر بالفعل لعدد من السنوات ، مما يساعد على شرح بعض الخصائص الأساسية للانتقال العصبي العضلي.

نأمل أن يسمح هذا الفيديو باستمرار الاكتشاف من خلال مساعدة المحققين على التعرف أكثر على هذه التقنية القوية والبسيطة.