البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تقارب الارتباط لتفاعل ترابط البروتين دون تنقية البروتين من محللة الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن البروتين المنصهر في GFP ذي الأهمية في أي خط خلية ملتصق. بعد تحضير مخففات محللة الخلية والترابط ، يتم تحضير مخاليط تحلل الخلايا وتحميلها في الشعيرات الدموية.

بعد ذلك ، يتم قياس المقاومة الحرارية للبروتين المنصهر في GFP في وجود تركيزات ترابط متفاوتة. الخطوة الأخيرة هي تحليل بيانات الفصادة الحرارية المجهرية أو قياسات MST. في النهاية ، يتم استخدام المقاومة الحرارية الدقيقة لتحديد صلات الارتباط للتفاعلات بين البروتينات المنصهرة في GFP والروابط المختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل المعايرة بالتحليل الحجمي أو قياس السعرات الحرارية أو البلازما السطحية هي أنها تتجنب تنقية البروتين ، وتبسيط وتسريع التوصيف الكمي للتفاعلات الثنائية بشكل كبير. تقدم هذه الطريقة مزايا كبيرة عند العمل مع البروتينات التي يصعب التعبير عنها وتنقيتها، مثل بروتينات الغشاء وعوامل النسخ. واحدة من أكبر مزايا الفصادة الحرارية المجهرية هي أنها تعمل في مجموعة متنوعة من المخازن المؤقتة وتتحمل وجود المنظفات وخلاياي في النظام ، وسيتم توضيح هذه التقنية كارين ستيفكا ، عالمة أحياء من مختبري لبدء غسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج أو PBS باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت لكل قارورة T 75.

احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة خمس دقائق أو حتى تبدأ في الانفصال عن القارورة. اكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلية لفصلها إذا لزم الأمر. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من PBS المثلج ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دائري ذو قاع دائري سعة 14 ملليلترا مبرد مسبقا.

حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 إلى 600 جي وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج. انقل المعلق إلى أنبوب einor مبرد مسبقا سعة 1.5 مل لاستخراج بروتينات العصارة الخلوية.

ضع الخلايا على الجليد لتقليل ارتفاع درجة الحرارة المحلية والخلايا بثلاث مرات عشر نبضات ثانية من الصوتنة في سعة 30٪. باستخدام طرف ما قبل البرد من ملليمترين إلى ثلاثة ملم ، احتفظ بالحافة أسفل السطح لتقليل الرغوة. احذف هذه الخطوة عند استخدام المنظف الذي يحتوي على عازلة واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة.

بدلا من ذلك ، قم بتصحيح محلول المحللة ليحتوي على تركيز ملح فسيولوجي يبلغ 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم إذا لزم الأمر من محلول مخزون من خمسة كلوريد صوديوم مولار. أخيرا ، اجمع المحللات عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 25،000 جي وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. حدد الصمام الثنائي الباعث للضوء أو مصدر إثارة LED بطول موجي يساوي 470 نانومتر على أداة MST.

قم بتحميل الشعيرات الدموية بمستخلص الخلية المخفف مرتين و 10 مرات باستخدام المخزن المؤقت MST ووضعها في أداة MST. قم بإجراء عملية البحث عن الشعيرات الدموية على برنامج التحكم في أداة MST. يتراوح نطاق التألق الأمثل في المحللة المخففة من 400 إلى 1500 وحدة مضانة.

تابع لتحديد نطاق تركيز الترابط الأمثل كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع رف أنبوبي بالعدد اللازم من أنابيب الطرد المركزي منخفضة الربط سعة 0.5 مل على ماصة الثلج 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت MST في قاع كل أنبوب عند 25 ميكرولتر من محلول مخزون الترابط إلى الأنبوب الأول وقم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج للرابط باستخدام بقية الأنابيب. احتفظ بالرف مع عينات الترابط على الجليد.

احسب تخفيف محللة الخلية للحصول على المستوى الأمثل للبروتين المستهدف الفلوري في تفاعلات الربط. يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي قريبا من ثابت تفكك الارتباط المتوقع أو أقل ، ويجب تعديله للحصول على العدد اللازم من أعداد التألق. في الحل النهائي ، تابع تخفيف محللة الخلية باستخدام MST Buffer.

ضع 0.5 ملليلتر أنابيب منخفضة الربط في رف الأنبوب عبر الأنابيب مع عينات التخفيف التسلسلي للترابط. أضف بعناية 15 ميكرولترا من محللة الخلية إلى قاع كل أنبوب. حاول ألا تلمس جدران الأنبوب لتجنب فقدان العينة.

أضف 15 ميكرولترا من عينة الترابط بأعلى تركيز إلى الأنبوب المقابل. رقم واحد ، مع محللة الخلية. تخلط جيدا وتغير طرف الماصة.

كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب باستثناء الأنبوب الأخير ، والذي يجب ألا يحتوي على ترابط. أضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت MST إلى الأنبوب الأخير واخلطه. املأ ما يقرب من ثلثي الشعيرات الدموية الأولى بخليط الربط من الأنبوب رقم واحد.

قم بإمالته لتحريك المحلول نحو المركز وضع الشعيرات الدموية على الدرج الشعري إلى الموضع. رقم واحد ، كرر هذه الخطوة مع بقية الشعيرات الدموية. يمكن توصيل النهايات الشعرية بالشمع لتجارب أطول.

ضع الدرج داخل أداة MST وأغلق باب الجهاز. بعد ذلك ، حدد مصدر الإثارة LED بطول موجي يساوي 470 نانومتر. في أداة MST ، قم بتنفيذ أمر البحث عن الشعيرات الدموية للسماح للأداة بالعثور على المواضع الدقيقة للشعيرات الدموية وقياس مضان العينات بناء على شدة إشارة الفلورسنت.

اضبط طاقة LED لإدخالها في الفاصل الزمني من 400 إلى 1500 وحدة. انقر فوق الزر "ابدأ" لإجراء تجربة المقاومة الحرارية. يمكن اختيار أكثر من طاقة ليزر بالأشعة تحت الحمراء للتجربة.

من أجل العثور على تدرج درجة الحرارة الأمثل لنظام معين ، يستغرق تشغيل مجموعة واحدة من 16 شعيرا دمويا من 10 إلى 12 دقيقة. اجمع البيانات من جولتين إلى ثلاث مرات لنفس مجموعة الشعيرات الدموية لضمان قابلية تكرار القياسات. لبدء تحليل البيانات ، افتح برنامج التحليل وقم بتحميل مجلد المشروع.

في عرض تشغيل المعلومات الظاهرة ، حدد أنه تم جمعه في منحنيات حرارية محددة لطاقة الليزر بالأشعة تحت الحمراء. كان هناك خيار لفتح جميع الآثار الحرارية التي تم جمعها في ظل ظروف مختلفة في وقت واحد ، ثم اختيار أي منحنيات للتحليل عن طريق تشغيلها وإيقافها. في نافذة الرسم البياني لنقاط التقييم ، حدد المقاومة الحرارية أو الفصادة الحرارية مع خطوطين أزرق وأحمر.

حدد منطقتين من المنحنيات التجريبية التي يتم تحديدها يدويا للتحليل بواسطة البرنامج. تأكد من وضع الخطين الأزرق والأحمر بشكل صحيح لتوفير أقصى تغيير في Thermal Resis. للحصول على متوسط النقاط مع الانحرافات المعيارية، حدد استخدام المتوسط أو تمييز عمليات التشغيل لعمليات تشغيل منفصلة.

لرسم ملاءمة ثابتة للتفكك ، حدد استخدام المتوسط ، وأدخل قيمة تركيز الجزيء المسمى وقم بإصلاحها وتناسب المنحنى. يظهر ثابت التفكك الملزم أو قيمة KD مع انحرافها المعياري في نافذة منبثقة منفصلة للمعلومات. احفظ متوسط بيانات الملاءمة في ملف نصي وانقلها إلى Excel.Heck.

تم استخدام 2 9 3 خلايا تعبر عن STAT 3G FP كمصدر للإحصائيات الثالثة المسماة بالفلورسنت. بالنسبة إلى ربط مقايسة ربط الحمض النووي لقليل النوكليوتيدات عالية الشحنة أدى إلى تغييرات كبيرة في حركة STAT الثلاثة. في تدرج درجة الحرارة.

يتم رسم إشارة الشبكية الحرارية كدالة لتركيز قليل النوكليوتيدات. تمثل كل نقطة بيانات متوسط ثلاثة قياسات. تم استخدام برنامج التحليل الزمني النانوي لملاءمة وتحديد قيم الديكورات الكويتية الظاهرة.

ثوابت التفكك الظاهرة 37.9 زائد أو ناقص 1.0 ميكرومولار للارتباط بزخارف الغاز ، و 23.3 زائد أو ناقص 0.6 ميكرومولار للارتباط بقليل النوكليوتيدات الغنية بالإضافة إلى 100. من المثير للدهشة أن s plus 100 تسلسل أظهر ارتباطا أكثر إحكاما قليلا من الغاز. في ثلاث تكرارات قياس ، أدى استبدال A إلى G إلى انخفاض كبير في تقارب s زائد 100 متحول.

في حين أن s زائد 100 متحولة اثنين لم تظهر أي ارتباط يمكن اكتشافه ، مما يؤكد الربط الانتقائي للتسلسل من STAT ثلاثة إلى s زائد 100 بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الظروف المثلى لاستخراج بروتينات الغشاء ستختلف باختلاف البروتينات وعادة ما تتطلب التحسين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تقارب البروتين الأنيق دون تنقية البروتين من الخلية. المحلل.