العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتصنيف العدلات من نخاع عظم الفأر للدراسات الوظيفية النهائية وتجارب النقل بالتبني. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع خلايا نخاع العظام أولا من المورين وعظم الفخذ والساق. خلال الخطوة الثانية ، يتم ربط خلايا الدم الحمراء بشكل تناضحي عن طريق تعليقها بالتتابع في محاليل كلوريد الصوديوم 0.2٪ و 1.6٪ على التوالي.

بعد ذلك ، يتم عزل العدلات عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة. في الخطوة الأخيرة ، يتم تصنيف العدلات بأصباغ تعقب الخلايا. في النهاية ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد العدلات المنقولة بالتبني التي يتم تجنيدها في أنسجة الفئران المختلفة.

الميزة الرئيسية لعزل عدلات الفئران من نخاع العظم على الدم أو الصفاق ، هي أنه يمكن الحصول على العدد الكبير من الخلايا الكافية للدراسات الوظيفية النهائية وتجارب النقل بالتبني من نخاع العظام أثناء الحالة المستقرة وبعد الإصابة. تتمثل ميزة استخدام تقنية الطرد المركزي المتدرج لعزل عدلات الفئران على الاختيار المغناطيسي المناعي لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة في أنها سريعة واقتصادية وتتجنب وضع العلامات على العدلات بالأجسام المضادة التي قد تحفز تنشيط العدلات. وتوضيح الإجراء سيكون muca swami لنا, فني من مختبري بعد رش فأر قتل رحيم مع 70٪ الإيثانول.

قم بعمل شق في منطقة البطن الوسطى من جلد ثم قم بإزالة أنسجة الجلد من الجزء البعيد من ، بما في ذلك الأطراف السفلية. بعد ذلك ، استخدم المقص لقطع العضلات من الأطراف الخلفية للحيوان ثم خلع بوم الإنجيوتنسين بعناية من مفصل الورك ، وتجنب كسر رأس عظم الفخذ. ثم استخدم المقص في مشرط لإزالة العضلة المتبقية من عظم الفخذ والساق.

افصل عظام الساق عند مفصل الركبة ، مع الحرص على عدم كسر نهايات العظام ، ثم ضع العظام في طبق بتري يحتوي على RPMI المثلج البارد 1 6 4 أوه. مكمل غذائي مع FBS والمضادات الحيوية. انقل الطبق إلى غطاء زراعة الأنسجة ثم قم بتعقيم الجزء الخارجي من كل عظم بنسبة 70٪ من الإيثانول في طبق بتري جديد.

بعد حوالي 10 إلى 15 ثانية ، اشطف الإيثانول من سطح كل عظم بثلاث غسلات لاحقة في PBS المثلج والمعقم. ثم اقطع وضع المشاشية من كل عظم في طبق بتري معقم جديد. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة قياس 25 بحقنة 12 سم مكعب مملوءة ب 10 مل من RPMI.

مكمل مع FBS و EDTA. ثم اغسل خلايا نخاع العظم من طرفي عمود كل زوج من قصبة عظم الفخذ على أنبوب فالكون العلوي اللولبي سعة 50 مليلتر باهت بمرشح 100 ميكرومتر لإزالة جميع الخلايا. اكشط الأسطح الداخلية للعظام بطرف الإبرة.

عندما تبدو العظام مبيضة ، تمت إزالة الخلايا بشكل كاف. استخدم الآن مشرطا لتقطيع المشاشية العظمية إلى قطع Q صغيرة من 0.5 إلى ملليمتر واحد ، ثم استخدم الطرف الخلفي لطرف مشط einor سعة 2.5 مل بالإضافة إلى طرف ماصة BioPure لتحطيمها من خلال مرشح 100 ميكرومتر. بعد تدوير الخلايا المحصودة لمدة سبع دقائق عند 427 مرة G وأربع درجات مئوية ، خلايا الدم الحمراء في 20 مل من 0.2٪ كلوريد الصوديوم لمدة 20 ثانية تقريبا.

ثم أوقف التحلل ب 20 مل من كلوريد الصوديوم 1.6٪ ، وقم بتدوير الخلايا ثم أعد تعليق الحبيبات في مكمل RPMI 1 6 4 oh مع FBS و EDTA. عد الخلايا ثم بعد تدويرها مرة أخرى ، قم بتعليق الحبيبات المغسولة بما لا يزيد عن 100 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر واحد من الجليد. يقوم برنامج تلفزيوني معقم بارد الآن بتوزيع ثلاثة ملليلتر من 18 إلى 26 درجة مئوية ، ومعتمه 1 1 1 9 في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، ثم قم بتراكب ثلاثة ملليلتر ببطء من 18 إلى 26 درجة مئوية.

له غير شفاف 1 0 7 7. تجنب خلط الكثافتين مباشرة بعد تحضير طبقة معتمة بعناية من تعليق خلية نخاع العظم أعلى جهاز الطرد المركزي المعتم 1 0 7 7 ، وتدرج الكثافة لمدة 30 دقيقة عند 834 مرة G و 25 درجة مئوية دون كسر ، ثم جمع العدلات في واجهة طبقات معتمة 1 1 1 1 9 و 1 0 7 7. بعد غسل العدلات التي تم جمعها مرتين في RPMI 1 6 4 oh FBS والمضادات الحيوية Resus يعلق الخلايا في خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في PBS Prewarm إلى 37 درجة مئوية.

بعد عد الخلايا ، احتفظ بكمية صغيرة من كل عينة تجريبية لتحديد النقاء والجدوى عن طريق قياس التدفق الخلوي ثم قم بتسمية العدلات المتبقية بصبغة تعقب الخلية بتركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مهتز في الظلام. أخيرا ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مكمل RPMI 1 6 4 oh المثلج مع FBS والمضادات الحيوية لتجنب التلوث المتبادل للصبغة قبل خلط مجموعات العدلات المصنفة بشكل تفاضلي لدراسات إعادة التوطين التنافسية النهائية هنا ، يتم عرض مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لنخاع العظم المعزولة الكثافة المتدرجة الجزئيات المنفصلة عن فأر C 57 الأسود ستة الفأر غير المصاب في هذه اللوحة. البوابة الأولية المستخدمة لخلايا نخاع العظم التي تم جمعها من واجهة المسار النسيجي 1 1 1 9 والمسار النسيجي 1 0 7 7.

باستخدام التشتت الأمامي والجانبي ، يتم إثبات أن العدلات المنفصلة عن التدرج في الكثافة أكبر من 90٪ نقية وأكبر من 95٪ قابلة للحياة لمدة أربع ساعات على الأقل بعد تعقب خلايا النقل بالتبني. يمكن تتبع عدلات تسمية DIA عن طريق قياس التدفق الخلوي في مشكلات الفئران المختلفة. على سبيل المثال ، في نخاع العظام في الدم والكلى للمتلقي المبيضات المصابة ب C 57 الفأر الأسود الستة الموضح في هذه التجربة عن طريق البوابات على خلايا CD 45 LY الحية ستة G CD 11 B ، يمكن تمييز هذه العدلات الممثلة المنقولة بالتبني عن العدلات السلبية الأصلية C-M-T-M-R و PE للفأر المتلقي من خلال تعبير PE الخاص بهم.

بمجرد إتقان عزل عدلات نخاع عظم الفأر ووضع العلامات عليها في ثلاث ساعات.