التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق نقص الأكسجة المتقطع على ثقوب البنكرياس الدقيقة للتحقيق في تأثيرات التكييف المسبق. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع جهاز موائع دقيقة متعدد الوسائط أولا بغشاء رقيق منفذ للغاز. الخطوة الثانية هي إنشاء نظام تعديل الأكسجين المحوسب.

يتم تحميل الثقوب التالية بعناية في الجهاز ، ثم يتم توصيل الموائع الدقيقة السائلة والأكسجين. الخطوة الأخيرة هي تنسيق الفحص المجهري مع الموائع الدقيقة متعددة الوسائط من أجل تصور معلمات العيينة التي يتم تغييرها أثناء تعديل الأكسجين. في النهاية ، يتم استخدام تقنية نقص الأكسجة المتقطع للعيينة لإظهار أن استجابة الجلوكوز ضعيفة بشكل واضح في نقص الأكسجة.

بينما يمكن للتعديلات الزمنية لنقص الأكسجة أن تدرب الثقوب على الاستجابة بضعف أقل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الأكسجين المذاب أو استخدام غرفة نقص الأكسجين ، هي تلك الدقة. يمكن توصيل تركيز الأكسجين إلى الجفون في فترات زمنية سريعة وصغيرة دون إجهاد شديد من التدفقات المعقدة.

كما يسمح بالمراقبة في الوقت الفعلي باستخدام الأرضية والفحص المجهري. يمكن أن يساعد هذا المعلم في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال زراعة ألي ، مثل تحديد ضعف نقص الأكسجين في مواقع الزرع أو أنظمة التكييف المسبق لتحسين نتائج الزرع. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لنقص الأكسجة في Alli.

يمكن أيضا تطبيقه على الأنسجة والأنظمة الأخرى مثل الجهاز العصبي المركزي وأنسجة القلب والكلى وأعضاء الزرع الأخرى. يعد عرض الفيديو لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث أن العديد من تصنيع الجهاز ومقبض العيينة. يصعب تعلم الخطوات بسبب الطبيعة الجديدة متعددة التخصصات لهذه التقنية ، ولكنها متأصلة في البداية الصعبة أو المألوفة من خلال تصنيع طبقة الغطاء لجهاز الموائع الدقيقة.

لتحقيق ذلك ، قم بصب DGAs مسبقا خلط PDMS على ارتفاع 1.5 ملم في طبق بتري فارغ ومعالجته عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتصنيع طبقة الموائع الدقيقة للجلوكوز باستخدام غرفة الوفرة الرئيسية عن طريق طلاء طبقتين بسمك 350 ميكرون من SU 8 21 50 لتشكيل طبقة واحدة 700 ميكرون على رقاقة سيليكون بحجم أربعة بوصات. ثم قم بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية باستخدام قناع صور طبقة الجلوكوز الدقيقة لنقل نمط القناة الدقيقة إلى طبقة SU الثمانية.

اشطف المنطقة غير المكشوفة باستخدام مطور SU Eight. بعد ذلك ، صب DGAs المختلطة مسبقا PDMS على MA حتى ارتفاع ثلاثة ملليمترات والمعالجة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. بمجرد المعالجة ، قم بقص طبقة الموائع الدقيقة للجلوكوز لتشكيلها واستخدم لكمة ملليمترين لتشكيل منافذ المدخل والمخرج ، بالإضافة إلى ثقب قطره ثمانية ملم للغرفة الرئيسية.

بعد ذلك ، قم بتصنيع سيد البئر الصغير لتثبيت الجفن عن طريق طلاء طبقة بسمك 100 ميكرون من SU 8 2100 على رقاقة سيليكون نظيفة بحجم أربعة بوصات ، ثم استخدم الطباعة الحجرية للأشعة فوق البنفسجية لنقل نمط البئر الصغير إلى هذه الطبقة. اشطف المناطق غير المكشوفة باستخدام المطور عند اكتمال microwell master. أضف طبقتين 100 ميكرون من PDMS عن طريق الطلاء الدوار عند 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، ثم المعالجة لمدة 10 دقائق عند 80 درجة مئوية لإنتاج كل طبقة.

بمجرد الانتهاء ، قم بثقب المدخل الذي يبلغ قطره ملليمترين في منافذ المخرج. أخيرا ، قم بتصنيع سيد الموائع الدقيقة للغاز عن طريق تدوير سمك SU 8 2100 إلى 100 ميكرون كما في الطبقة السابقة ، ونقل أنماط الموائع الدقيقة للغاز مرة أخرى باستخدام الطباعة الحجرية للأشعة فوق البنفسجية. اشطف المنطقة غير المكشوفة باستخدام المطور.

بعد ذلك ، اسكب طبقة بسمك 1.5 ملم من PDMS على سيد الموائع الدقيقة للغاز وقم بمعالجتها عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم قم بقص PDMS لتشكيل بشفرة الحلاقة. ثم قم بثقب منفذي مدخل ومخرج بقطر ملليمترين في طبقة الغطاء لتتماشى مع المكان الذي توجد فيه في الطبقات الأخرى لربط الطبقات المتعددة معا.

أولا ، قم بإعدادها عن طريق تنظيف الأسطح بشريط سكوتش ، وتعريضها لقوس كورونا ، ثم محاذاة الطبقات يدويا بالترتيب التالي. أولا ، اربط الغشاء بطبقة الغاز السفلية بحيث تكون الآبار الصغيرة متجهة لأعلى. ثم ربط طبقة الجلوكوز الموائع الدقيقة أعلى غشاء البئر الصغير.

أخيرا ، قم بربط طبقة المدخل والمخرج في الأعلى ، مع تغليف المجموعة بأكملها. ساعد في تكوين رابطة محكمة عن طريق إضافة وزن كيلوغرام واحد فوق المجموعة وخبزها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم تسرب.

اختبر الجهاز عن طريق تحميل الماء إلى الطبقة المائية ، وغمر الجهاز وتدفق الهواء عبر طبقة الغاز مع المحقنة أثناء البحث عن التسريبات. أخيرا ، قم بتعقيم الأجهزة الخالية من التسرب عن طريق تمرير 70٪ من الإيثانول عبر الطبقة المائية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. قم بإعداد الموزعات الصغيرة عن طريق توصيل أسلاك التحكم في الموزعات الصغيرة أولا بوحدات التشغيل المضمنة.

ثم قم بتوصيل برامج التشغيل بلوحة الإدخال والإخراج الرقمية في المنافذ المقابلة لعناصر التحكم في عرض المختبر الخاصة بهم. بعد ذلك ، قم بتوصيل مصادر طاقة خمسة فولت و 20 فولت تيار مستمر بجهات الاتصال المقابلة لها على وحدات محرك الأقراص وقم بتوصيل IO الرقمي بجهاز كمبيوتر محمول من أجل تنفيذ رموز عرض المختبر للتحكم في الغاز كما هو موضح في ملحق بروتوكول النص المصاحب. ثم قم بتوصيل موزع دقيق بالنيتروجين والآخر بالهواء المضغوط ، وكلاهما يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون واضبط كلا الغازين على اثنين من PS. أقوم بتوصيل مخرجات الموزع في تقاطع T قبل دخول جهاز الموائع الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتركيب الجهاز على المرحلة الساخنة من المجهر المقلوب مع 0٪ و 21٪ أكسجين متصل بالجهاز. بعد ذلك ، ضع مستشعر الأكسجين الليفي البصري عند إخراج السائل للجهاز لقياس الأكسجين المذاب داخل الإخراج في الوقت الفعلي. ثم قم بتوصيل الجهاز بمضخة تمعجية وابدأ في تدفق المياه عبر الجهاز بسرعة 250 ميكرولتر في الدقيقة.

قم بتمييز الاستجابة العابرة لتعديل الأكسجين عن طريق تدوير الموزعات الدقيقة بين خمسة و 21٪ من الأكسجين. قم بتوصيل مضخة تمعجية بجهاز الموائع الدقيقة وضع الأنبوب فوق لوح تسخين 37 درجة مئوية لتسخين السائل قبل دخوله إلى جهاز الموائع الدقيقة. أيضا ، قم بتوصيل منفذ إخراج الموائع الدقيقة للجلوكوز بمجمع الكسر لبدء تشريح C 57 ستة فئران سوداء وعزل ثقوب البنكرياس عن طريق هضم الكولاجيناز وفصل تدرج كثافة F ccal كما هو موضح في مقاطع الفيديو التالية المتاحة من JoVE بمجرد عزلها.

احتضان الثقوب في وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 20 مللي مولار في أطباق بتري لمدة 24 إلى 48 ساعة. استخدم الثقوب في غضون يومين لضمان نتائج متسقة. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزن مؤقت جديد لبيكربونات كريبس رنجر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب مع محلول واحد يحتوي على اثنين من الجلوكوز المليمولي وآخر يحتوي على 14 مليمولار جلوكوز.

قم بتسخين المحاليل في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر عن طريق وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم قم بإعداد البقعة للثقوب المعزولة عن طريق إضافة خمسة ميكرومولار من 4:02 صباحا و DMSO و 2.5 ميكرومولار من RH 1 23 و 100٪ إيثانول إلى ملليلترين من مخزن كريبس الذي يحتوي على ملليمولار من الجلوكوز. بعد ذلك ، التقط الثقوب بماصة سعة 10 ميكرولتر واحتضنها في البقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بمجرد تلطيخها ، قم بتحميل ما يقرب من 20 ثقبا في الجهاز عبر مدخل قناة الجلوكوز الدقيقة. قم بتوجيه الثقوب إلى الغرفة عن طريق تحضير المخزن المؤقت من المخرج مرة أخرى إلى المدخل. ثم قم بتقطيع الثقوب وتخزينها لمدة 10 دقائق لغسل الأصباغ الزائدة.

أولا ، ارسم اثنين من ملي مولار من بيكربونات كريبس عبر النظام لمدة خمس دقائق لإنشاء خط أساس طبيعي للنبض. ثم حفز الغرفة باستخدام مخزن الجلوكوز 14 مليمولار لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بغسل لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول الجلوكوز المليمولي. خلال هذه العملية ، سجل 510 نانومتر لانبعاثات اثنين عن طريق إثارة النظام الغذائي 340 نانومتر و 380 نانومتر.

أيضا ، سجل انبعاث 530 من RH 1 23 عن طريق إثارة الصبغة عند 480 نانومتر. لتقليل اضطرابات الحمل الحراري أثناء تعديل الأكسجين ، قم بتطبيق التدفق العازل أثناء خطوات التحفيز والغسيل ، وتأكد من إيقاف التدفق في الخطوات الأخرى أثناء الاختبار. اجمع النفايات السائلة من مخرج الجلوكوز على فترات دقيقة واحدة لاستخدامها في تحليل إضافي باستخدام نهج الموائع الدقيقة الموضح في هذا الفيديو ، فمن الممكن تنظيم النسبة المئوية للأكسجين المتدفق عبر غشاء PDMS الرقيق بسرعة باستخدام الحقن الدقيق المحوسب.

فيما يلي مثال على هذا التعديل الذي يتراوح من دقيقة واحدة إلى ست دقائق. من الممكن أيضا توفير تعديلات كمية دون دقيقة للأكسجين بين اثنين و 8.5 أجزاء في المليون عن طريق توصيل الأكسجين بين خمسة و 21٪ يوضح الخط الأزرق النسبة المئوية للأكسجين الذي يتم تسليمه والأخضر هو الأكسجين المذاب الناتج في أجزاء في المليون. عندما يتم تطبيق هذا التدوير لخلق نقص الأكسجة المتقطع في الثقوب ، يمكن للمرء أن يلاحظ فوائد التكييف المسبق للثقوب ضد نقص الأكسجة مقارنة بالنبض النورموكسيك غير المنتظم من خلال ملاحظة النسبة المحسنة للنسبة بعد العلاج يمكن ملاحظة آثار نقص الأكسجة ونقص الأكسجة المتقطع في التخميد المفرط والتذبذب لعابرات الكالسيوم كما هو موضح هنا باللون الأزرق هي الاستجابة الطبيعية.

باللون الأحمر هي استجابة نقص التأكسج ، والخط الأخضر هو استجابة نقص الأكسجين المشروطة. يظهر هنا مقياس الكالسيوم وإمكانات الميتوكوندريا والأنسولين. إنها نتائج الفحص المجهري الفلوري في الوقت الفعلي ومقايسة EISA خارج الشريحة باستخدام التدفق السائل الدقيق من النظام معا ، وتبدأ هذه في بناء عرض متعدد الوسائط لاستجابة الأنسولين الجلوكوز تحت نقص الأكسجين.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، ويوم واحد لتصنيع الجهاز وعزل خلايا الجفن ويوم واحد لتجارب الجفن نفسها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من تركيز الأكسجين الذي تم تسليمه عن طريق الزواج من جهاز الغاز الخاص بالجهاز بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مخرج الجنين وعلم وظائف الأعضاء الدقيقة للأنسجة الأخرى لاستكشاف كيف يمكن أن يؤثر نقص الأكسجة وأنماط الأكسجين المؤقتة على أمراض مثل مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والاضطرابات العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحكم في تعديل الأكسجين ، ومعالجة الأنسجة الدقيقة ، وإنشاء قياسات قابلة للتكرار وذات مغزى لنقص الأكسجة في الأنسجة باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة متعددة الوسائط.