A Perifusion جزيرة متعدد حدودي النظام داخل جهاز ميكروفلويديك Perifusion

سنقوم في هذا العرض التقديمي بتقديم نظام تروية للجزر البنكرياسية يعتمد على الموائع الدقيقة للقياس المتزامن لإفراز الإنسولين الديناميكي، وتدفق الكالسيوم، وتغيرات الجهد الميتوكوندري في الجزر البنكرياسية استجابةً للمواد المحفزة لإفراز الإنسولين. يتكون نظام التروية من جهاز موائع دقيقة مكون من ثلاث طبقات، ومضخات حقن، ومجمع أجزاء. ويتم تصوير تدفق الكالسيوم والجهود الميتوكوندرية الناتجة عن المحفزات الإفرازية باستخدام إعدادات المجهر الفلوري.

مرحباً، اسمي أولا، باحثة من مختبر الدكتور فال هولتر في قسم جراحة زراعة الأعضاء بجامعة إلينوي في شيكاغو. مرحباً، أنا دون لي، أيضاً من مختبر هولتر. مرحباً، أنا تريشيا هارت، أيضاً من مختبر الدكتور فال هولتر.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير المتزامن للجفن باستخدام تدرج خطي للجلوكوز. لقد استخدمنا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مرئيات ووظائف الجفون. لذا، فلنبدأ.

يتم تجميع الجهاز الموائع الدقيقة المستخدم في هذا الإجراء من ثلاث طبقات من مادة PDMS المعالجة والمُنتجة بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. تحتوي الطبقة الأولى، والمُنتجة من قالب سيليكون، على آبار الجهاز الموائع الدقيقة التي ستثبت العروات برفق في مكانها، بعمق 150 micrometers وقطر 500 micrometers. أما الطبقة الثانية فتحتوي على قنوات بارتفاع 500 micrometers وعرض two millimeters.

يتم توسيع منتصف القناة لتوزيع التدفق من أجل تحسين تبادل المحلول. وبداخل الجهاز، يتم إنشاء بئر التبادل عن طريق ثقب فتحة بارتفاع 3 mm وعرض 7 mm في منتصف الطبقة. أما الطبقة الثالثة فهي عبارة عن لوح سميك من PDMS. ولتحضير هذه الطبقة، قم بثقب فتحات صغيرة على كلا الجانبين بحيث تتماشى مع مدخل ومخرج القناة.

في الطبقة الثانية، وبمجرد إنشاء الطبقات الثلاث جميعها، يتم ربط الطبقة الأولى بشريحة زجاجية بحيث تكون الفتحات متجهة للأعلى. ثم تُربط الطبقة الثانية بالطبقة الأولى مع توجيه تباعد القنوات للأعلى. وأخيراً، تُربط الطبقة الثالثة بالطبقة الثانية.

بمجرد ربط الطبقات ببعضها، يصبح الجهاز جاهزاً للاستخدام في التجارب. وباستخدام محقنة سعة 10 milliliter مملوءة بـ 70%ethanol ومتصلة بمنفذ الإدخال في الجهاز بواسطة أنابيب Tai، يتم تعقيم الجهاز الموائع الدقيقة عن طريق تمرير ethanol عبر قنوات الجهاز. بعد ذلك، وباستخدام نفس الإعداد، يتم تمرير الماء منزوع الأيونات لغسل ethanol.

بمجرد تعقيم الجهاز، ضعه على منصة مجهر مسخنة باستخدام أنابيب tigon، وقم بتوصيل مضخات الحقن التي تحتوي على محاليل جلوكوز بتركيزات عالية ومنخفضة بموصل على شكل Y. ثم قم بتوصيلها بمدخل الجهاز الموائع دقيقة (microfluidic device). وصِل مخرج الجهاز الموائع دقيقة بمجمع أجزاء (fraction collector).

تأكد من وضع الأنابيب على لوح تسخين بدرجة حرارة 37 °C. من المهم جداً الحفاظ على المحاليل في درجة الحرارة الفسيولوجية طوال فترة التجربة. بعد ذلك، استخدم برنامج LabVIEW لبدء تدرج الجلوكوز الذي سيتم ضخه عبر الشبكة الموائع دقيقة خلال التجربة.

يقوم هذا البرنامج بتغيير معدل تدفق محلولين من الجلوكوز. ومن خلال التحكم في مضخات الحقن، يمكن إنشاء أنماط متنوعة من تدرج الجلوكوز هنا، سواء كانت أنماطاً خطية، أو جرسية الشكل، أو مربعة الشكل. وبالمقارنة مع القيم المتوقعة المحسوبة التي يتم عرضها في هذه التجربة، سيتم استخدام تدرج خطي من 2 millimolar إلى 25 millimolar من الجلوكوز بمعدل تدفق متغير قدره 0.01 milliliters per minute لمحلولي الجلوكوز، ومعدل تدفق ثابت قدره 0.25 milliliters per minute يدخل إلى الجهاز بعد خلط المحاليل.

بمجرد اختيار ملف التدرج المناسب، اختبر استقرار التدرج. أولاً، ابدأ تشغيل نظام التدرج. ثم ابدأ تشغيل جامع الكسور واجمع ثماني قطرات من الرشاحة في أنابيب Eppendorf سعة 1 mL.

بعد ذلك، استخدم مقياس الجلوكوز لاختبار تركيز الجلوكوز في كل أنبوب باستخدام برنامج excel. قم بتحليل النتائج التي تم الحصول عليها من مقياس الجلوكوز. بعد ذلك، استبدل سرنجة الجلوكوز المرتفع بسرنجة تحتوي على محلول 0.5%BSA في محلول Krebs ringer المنظم، ثم قم بتروية 50 milliliters عبر الجهاز بمعدل 1 milliliter في الدقيقة.

سيعمل ذلك على منع الامتصاص غير النوعي للإنسولين في جدران القناة الدقيقة لضمان الدقة عند قياس مستويات الإنسولين المفرزة لاحقاً بعد التروية باستخدام BSA. استبدلها بمحلول الجلوكوز العالي reus. علّق من 25 إلى 30 من عيينات عيون الفئران المختارة يدوياً في محلول Krebs ringer buffer بتركيز 2 mM من الجلوكوز، يحتوي على صبغة مؤشر الكالسيوم fira 2:00 AM وصبغة مؤشر الجهود الميتوكوندرية rumine 1 2 3، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

بعد فترة التحضين، افصل الجهاز عن نظام التروية وقم بتحميل الجزر بدقة في الجهاز المائع دقيق القنوات عن طريق إدخال طرف الماصة، التي تحتوي على الجزر، في منفذ الإدخال، وتوزيع الجزر ببطء. بعد التحميل، أعد توصيل الجهاز بنظام التروية، مع توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات هوائية. بعد ذلك، ابدأ بتشغيل مضخة الحقنة لبدء تروية الجزر بمحلول KRB الذي يحتوي على 2 mM من الجلوكوز.

ستعمل هذه الخطوة على غسل الصبغة الزائدة من الوسط، وتحديد مجموعات مرشحات الإثارة والانبعاث وأوقات التعرض التي سيتم استخدامها أثناء التجربة. بعد ذلك، اضبط مجمّع الأجزاء للجمع على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة أثناء استخدام العيون مع محلول الجلوكوز المنخفض. استخدم أداة المنطقة ذات الأهمية أو ROI من برنامج تصوير PCI البسيط لتحديد المناطق أو العيون التي ترغب في تصويرها.

كذلك، قم بتحديد منطقة الخلفية التي سيتم طرحها بعد غسل الخلايا لمدة 10 دقائق، وقم بتشغيل جامع أجزاء تدرج الجلوكوز وبدء التصوير بفاصل زمني. بعد 30 دقيقة، قم بإيقاف تشغيل البرنامج ومضخة محقنة الجلوكوز العالي. استمر في التروية باستخدام الجلوكوز المنخفض لإزالة تأثير الجلوكوز العالي.

بعد مرور 10 دقائق، أوقف تدفق الجلوكوز المنخفض عن طريق إيقاف تشغيل مضخة المحقنة. عقب عملية التروية، قم بتصدير البيانات إلى برنامج excel لتحليلها. يمكن تحديد كمية الأنسولين المفرزة في سائل التروية باستخدام ELA mouse eyelets.

تم التروية بتدرج خطي من الجلوكوز بتركيز يتراوح من 2 إلى 25 millimolar كما هو موضح هنا. يتم تحفيز تدفق الكالسيوم وإفراز الإنسولين بعد حوالي 13 دقيقة من التروية، وهو ما يتوافق مع تركيز 6 millimolar من الجلوكوز. وتظهر التغيرات في الجهود الميتوكوندرية في وقت أبكر، كما هو متوقع، عند حوالي 11 دقيقة.

توضح هذه البيانات ميزة استخدام هذه الشبكة الموائعية الدقيقة لتوصيف فيزيولوجيا العيون الصغيرة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية استخدام جهاز الدمج الموائعي الدقيق الخاص بنا لدراسة فيزيولوجيا العيون الصغيرة. عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر التأكد من عدم وجود فقاعات في الجهاز، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحرك العيون الصغيرة أثناء التجربة.

علاوة على ذلك، يمكن تعديل معدل التدفق ليصل إلى 1 ml في الدقيقة دون إزعاج الفتحات. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجربتكم.