الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد تعبير البروتين المنشط بالميتوجين على مستوى الخلية الواحدة. لتحقيق ذلك ، تم إنشاء سلالة خميرة تحمل مراسل التعبير الفلوري رباعي كوكب الزهرة الذي يتحكم فيه مروج STL واحد وخاص بتنشيط خنزير واحد خريطة كيناز. يمكن قياس تعبير البروتين الفلوري إما عن طريق مقايسة مجهرية للخلايا الحية يتم فيها الضغط على الخلايا مباشرة على المجهر لتسهيل الظهور في الوقت الفعلي للتألق أو عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وفي هذه الحالة يتم الضغط على الخلايا في أنبوب دقيق ويتم حظر تخليق البروتين في وقت معين.

من خلال إضافة cyclo heide ، يمكن تحليل عدد قليل فقط من الخلايا في كل مرة باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية ، ولكن يمكن ملاحظة مصير الخلايا الفردية بشكل مباشر وربطه بقياس التدفق الخلوي للخصائص الخلوية الأخرى ، من ناحية أخرى ، يسمح أيضا بتقييم تعبير البروتين المنشط بالميتوجين على أعداد كبيرة من الخلايا في وقت واحد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الإشارات ، مثل البروتينات التي تشارك في تنظيم التعبير الجيني. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمسار الخميرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على سلسلة إشارات أخرى اعتمادا على توافر التعبير المناسب. مراسل.

لتحضير الخلايا للفحص المجهري للخلايا الحية ، ابدأ بتلقيح خمسة ملليلتر من الوسط الاصطناعي بالخميرة ثم قم بتنمية الخلايا عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، قم بقياس OD 600 للثقافة الليلية ثم قم بتخفيف الثقافة الليلية في خمسة ملليلتر من الوسط الاصطناعي إلى OD 600 من 0.05. قم بزراعة الثقافة المخففة عند 30 درجة مئوية لمدة أربع ساعات أخرى على الأقل.

بعد ذلك ، قم بتصفية حوالي 200 ميكرولتر من محلول conna valent المحضر حديثا في شريحة البئر. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة المحلول وأضف 150 ميكرولتر من الماء إلى البئر. الآن قم بإزالة الماء واترك البئر يجف أثناء تحضير الخلايا.

قم بقياس OD 600 لثقافة الخلية مرة أخرى ، ثم قم بتخفيف الخلايا للحصول على 300 ميكرولتر من زراعة الخلايا عند OD 600 من 0.02 وأنبوب صغير سعة 1.5 ملليلتر. قم بالاتصال بالخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية. دوامة الأنابيب الدقيقة لفترة وجيزة ثم صوتنة الخلايا ودوامة مرة أخرى.

أضف الآن 200 ميكرولتر من الخلايا إلى شريحة البئر ، ثم بعد ترك الخلية تستقر في قاع البئر لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ضع الشريحة على المجهر. بعد ذلك ، حدد إعدادات الإضاءة لقناة الفلورسنت الخاصة بهم المراد تسجيلها ولصورتين للمجال الساطع ، وضبط أحد إعدادات المجال الساطع حوالي ثلاثة ميكرون أسفل المستوى البؤري للسماح بتجزئة الخلايا بشكل صحيح. ثم قم بتعيين الفواصل الزمنية لقياسات الفاصل الزمني وحدد مجالات الرؤية للتصوير.

ابدأ الآن في الاستحواذ لبضعة إطارات ثم أوقف عملية الاستحواذ مؤقتا لإضافة 100 ميكرولتر من وسط كلوريد الصوديوم 0.6 مولار المحضر حديثا ، واستأنف التصوير لإعداد الخلايا للقياس عن طريق قياس التدفق الخلوي. ابدأ بتلقيح الخميرة في خمسة ملليلتر من الوسط الاصطناعي وقم بتنمية الخلايا بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بقياس OD 600 للثقافة الليلية ثم قم بتخفيف تعليق الخلية في خمسة ملليلتر من الوسط الاصطناعي إلى OD 600 من 0.1.

قم بزراعة المزرعة لمدة أربع ساعات على الأقل عند 30 درجة مئوية للوصول إلى OD 600 من 0.2 إلى 0.4. ثم أضف 100 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 0.6 مولار المحضر حديثا إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 ملليلتر لكل نقطة زمنية يتم قياسها في الوقت الصفر. أضف 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل أنبوب دقيق واحتضان الثقافات مع الاهتزاز عند 30 درجة مئوية.

ثم في كل نقطة زمنية تجريبية ، أضف 30 ميكرولترا من cyclo heide المحضر حديثا إلى أحد الأنابيب الدقيقة. أثناء احتضان الأنابيب الدقيقة ، أضف 400 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب فاكس واحد مقابل لكل أنبوب صغير. بعد الحضانة ، قم بدوامة الأنابيب الدقيقة لفترة وجيزة ثم صوتنة الخلايا وإضافة حمام مائي لمدة دقيقة واحدة كما هو موضح للتو.

ثم أضف 100 ميكرولتر من زراعة الخلايا من كل أنبوب صغير إلى أنبوب الفاكس المقابل له عند تدفق مقياس الخلويات. قم بتحميل إعدادات الإثارة والكشف المناسبة واختبر العينات غير الشفصة والمعبر عنها بالكامل للتحقق من أنها تقع في نطاق حساسية الكاشف. أخيرا ، قم بقياس 10 ، 000 خلية لكل عينة في هذه الصور ، تم تحفيز خلايا الخميرة التي تحمل التعبير عن البروتين الوريدي الرباعي تحت سيطرة محفز TL واحد وتعلق على الجزء السفلي من شريحة البئر بواسطة إصدار مباشر من وسط الإجهاد.

كما هو موضح للتو ، تمت مراقبة الخلايا لمدة ساعتين تقريبا كل 10 دقائق ، وتم الحصول على الصور قبل وبعد إصدار التحفيز. لاحظ التعبير الفلوري للتقرير أثناء الخلايا المنشطة. لاستخراج المعلومات الكمية الواردة في هذه الصور ، يجب إجراء عملية تحليل صور معقدة هنا.

يتم عرض النتيجة التي تم الحصول عليها من منصة التحليل الكمي للخميرة. يمثل كل أثر أحمر التطور الزمني لمتوسط شدة التألق لخلية واحدة. يوضح الخط الأزرق متوسط أكثر من 500 خلية تم تقسيمها وتتبعها خلال 20 إطارا من خمسة أفلام بفاصل زمني تم الحصول عليها من خمسة مجالات رؤية مختلفة من نفس البئر ، تمثل المنطقة الزرقاء الفاتحة النسبة المئوية 25 و 75 من جميع الشدة المقاسة في نقطة زمنية معينة لدراسة ديناميكيات التعبير عن نفس المراسل عن طريق قياس التدفق الخلوي تمت إضافة Cycloheximide إلى الخميرة مزارع الخلايا في نقاط زمنية مختلفة على فترات من خمس إلى 10 دقائق.

يمنع الدواء تخليق البروتينات الجديدة ، لكن نضوج البروتين الفلوري الذي تم التعبير عنه بالفعل لا ينزعج. لذلك ، يمكن تحديد تعبير البروتين الذي يتصوره إزاحة الرسم البياني إلى اليمين في وقت إصدار Cycl H الذي يتحايل على المشكلات المرتبطة بنضوج البروتين الفلوري. في هذا الرسم البياني ، تتم مقارنة ديناميكيات مراسل التعبير كما تم قياسها بواسطة الفحص المجهري أو قياس التدفق الخلوي بينما ترتفع إشارة الفلورسنت بعد 30 إلى 40 دقيقة من إصدار وسط الإجهاد كما تم قياسه بواسطة المجهر ، تشير قياسات قياس التدفق الخلوي بوضوح إلى أن البروتينات يتم إنتاجها بالفعل بين 10 إلى 15 دقيقة بعد المنبه مما يدل على النضج البطيء لبروتينات الفلورسنت.

تسمح كلتا الطريقتين بالوصول إلى معلومات الخلية المفردة لهذه التجارب البسيطة ، والتباين بين ثلاث مكررات بيولوجية صغير مقارنة بالتباين الكبير الذي لوحظ في استجابات الخلية المفردة عن طريق الفحص المجهري أو قياس التدفق الخلوي. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياسات الاستجابة هذه من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، وهي عتبة التعبير الجيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تعبير البروتين على مستوى الخلية المفردة باستخدام مجهر قياس التدفق الخلوي.