التصنيع الدقيق لأنماط ذهب نانوية مسامية للدراسات التفاعل الخلوي المواد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع أنماط الذهب النانوية المسامية الدقيقة وإثبات توافقها مع زراعة الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء أقنعة الطباعة الحجرية أو الاستنسل أولا. الخطوة الثانية هي رش الذهب والفضة من خلال الأقنعة لتصميم سبيكة السلائف للذهب المسامي النانوي.

بعد ذلك ، يتم خلط أنماط سبائك الذهب والفضة في حمض النيتريك لإنتاج طلاءات ذهبية مسامية نانوية. تتمثل الخطوة الأخيرة في زراعة الخلايا فوق الأنماط الدقيقة الذهبية المسامية النانوية وتلوينها في النهاية ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح إلى جانب تحليل الصور لتحديد تفاعلات مواد الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى لإنشاء الطلاءات ذات الهيكل النانوي ، مثل أنابيب الكربون النانوية ، هي أن الذهب النانوي المسامي يستفيد من توافق التصنيع الدقيق ، ومساحة السطح الفعالة العالية ، وسهولة الوظيفة مع الكيمياء القائمة على البلاط ، والتوصيل الكهربائي ، والتوافق الحيوي.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم المواد والهندسة الحيوية ، مثل تأثير البنية النانوية للمواد على الخصائص الكهربائية والميكانيكية والبيولوجية والكيميائية. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لتأثير بنية النانو على مورفولوجيا الخلية. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية وأنظمة توصيل الأدوية ومنصات تخزين الطاقة.

ابدأ هذا الإجراء بتنظيف شرائح المجهر بوصة × ثلاث بوصات وزلات الغطاء الصغيرة بمحلول سمكة البيرانا ، وقم بتحميل الغطاء الصغير في قارب تلطيخ مناعي من البورسلين واغمر القارب وشريحة المجهر في محلول سمكة البيرها. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل حول إجراء التنظيف. بعد التنظيف ، انقل العينات إلى أطباق التبلور واشطفها بالماء لمدة ثلاث دقائق.

ضع العينات على مناشف خالية من النسالة وجففها بمسدس نيتروجين لإنشاء أنماط مقياس ملليمتر. قم بثقب صفائح مطاطية من السيليكون بسمك 250 ميكرون باستخدام خزعة. نظف صفائح المطاط الصناعي المعالجة عن طريق غمرها في 70٪ من الأيزوبروبانول ثم جففها بمسدس نيتروجين.

ثم ضع ورقة الثقب على منشفة خالية من النسالة وقم بمحاذاة زلات الغطاء النظيفة فوق الاستنسل بحيث يكون سطح العينة مواجها للاستنسل. انقل الاستنسل مع انزلاق الغطاء على رقاقة حاملة لإنشاء أنماط مقياس دون المليمتر. ضع مجهرا نظيفا ، وانزلق على ظرف دوار وقم بتفجير أي جزيئات بمسدس نيتروجين.

استغن عن 1.5 مل من سداسي ميثيل ديلان على الشريحة الزجاجية. باستخدام ماصة بلاستيكية، انشر سداسي ميثيل ديلان عن طريق تدوير الشريحة على التوالي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة خمس ثوان و1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. عند الانتهاء ، اخبز الشريحة على طبق ساخن على حرارة 115 درجة مئوية لمدة سبع دقائق ، ثم اتركها تبرد لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتوزيع أربعة ملليلتر من الصورة الإيجابية. مقاومة على الشريحة الزجاجية. انشر مقاومة الصورة عن طريق تدوير الشريحة باستخدام الشروط الموضحة سابقا.

تخبز الشريحة على طبق ساخن على حرارة 115 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة ثم قم بإزالتها بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية والخبز. قم بإذابة الصورة المكشوفة. قاوم عن طريق غمر الشريحة في صورة إيجابية.

قاوم المطور لمدة 3.5 دقيقة على الأقل. عند الانتهاء ، اشطف الشريحة جيدا بماء DI وافحص الأنماط المطورة تحت المجهر البصري. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات في آلة الاخرق التي يمكنها إيداع الذهب والفضة والكروم بشكل مستقل.

قم بتنظيف العينات لمدة 90 ثانية عند 50 واط تحت جو معالجة 25 مللي من الأرجون قبل بدء ترسيب المعدن تحت 10 ملليتور Argonne Sputter Chrome لمدة 10 دقائق عند 300 واط. ثم رش الذهب لمدة 90 ثانية عند 400 واط ، متبوعا بالذهب والفضة لمدة 10 دقائق مع الفضة عند 200 واط والذهب عند 100 واط. قم بإيقاف تشغيل مصدر الرش الذهبي قبل 10 ثوان تقريبا من إيقاف تشغيل مصدر الرش الفضي.

قم بإزالة العينات من آلة الاخرق بعد إزالة العينات من آلة الاخرق. صوتية لهم في حوالي 180 مل من الصورة الإيجابية. مقاومة متجرد لمدة 10 دورات من صوتنة 22 مع توقفات دقيقة بين الدورات.

عند الانتهاء ، اشطف العينات بالماء وجففها بمسدس نيتروجين. افحص الأنماط المعدنية تحت المجهر. ثم قشر استنسل المطاط الصناعي من العينات المطلية غير المقاومة للصور باستخدام ملاقطين للكشف عن المعدن المودع.

عالج زلات الغطاء الصغيرة ببلازما الهواء عند 10 واط لمدة 30 ثانية قبل غمرها في حمض النيتريك. De سبيكة ينزلق المجهر عن طريق غمرها في دورق من حمض النيتريك بنسبة 70٪ عند 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بمجرد اكتمال إزالة السبائك ، اشطف العينات عن طريق غمرها على التوالي في أكواب من الماء ثلاث مرات لكل منها.

ضع العينات على مناشف خالية من النسالة وجففها بمسدس نيتروجين. اضبط درجة حرارة اللوح الساخن على ما بين 150 و 300 درجة مئوية. ثم اخفض العينات ببطء على السطح الساخن لتقليل التغير المفاجئ في درجة الحرارة.

بعد خمس دقائق ، أخرج العينات من اللوح الساخن لتبرد. ضع عينات الذهب النانوي المسامية في أطباق البوليسترين وعالجها ببلازما الهواء عند 10 واط لمدة 30 ثانية. ثم انقل العينات إلى 24 لوحة لزراعة أنسجة البئر.

أضف 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع الكاملة لكل منها. قم بتخزين الأطباق جيدا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى بذر الخلايا. الحفاظ على خلايا الخلايا النجمية الفئران في قوارير T 75 مع وسائط الاستزراع.

بمجرد أن تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ ، قم بتمريرها عن طريق إزالة الوسائط القديمة أولا وغسل الخلايا باستخدام PBS. راجع البروتوكول النصي للحصول على تفاصيل حول ظروف المسافرين. بعد إزالة ألواح الثقافة من الحاضنة ، قم بشفط الوسائط المستهلكة من الآبار وزرع الخلايا على الزجاج.

ينزلق الغطاء بكثافة 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع بحجم نهائي يبلغ مليلتر واحد. رج لوحة الثقافة لضمان طلاء موحد للخلايا فوق العينات وضع لوحة الثقافة في الحاضنة عندما تكون الخلايا جاهزة للتحليل. قم بإزالة الوسائط المستهلكة من الآبار واغسلها مرتين باستخدام PBS.

بمجرد تثبيت الخلايا في 4٪ من الفورمالديهايد في PBS وغسلها مرتين ، قم بتثبيتها في 500 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X 100 في PBS لمدة خمس دقائق. كرر غسل PBS مرتين وانقل الخلايا لتنظيف الآبار. امسح 80 ميكرولترا من محلول التلوين على العينات واحفظها مغطاة بورق الألمنيوم لمدة 20 دقيقة.

بعد غسل PBS آخر ، قم بتلطيخ الخلايا بثلاثة نانومولار من DPI في PBS لمدة خمس دقائق. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرة أخرى واغمسها في di ثم قم بتركيب الخلايا على الزجاج. قم بتغطية الشرائح بوسائط التثبيت وإغلاقها بصورة طلاء أظافر واضحة.

أسطح الذهب النانوي المسامي بمجهر إلكتروني ماسح مع تكبير 50،000 × عند طاقة إلكترون 10 كيلو فولت باستخدام كاشف إلكتروني ثانوي. بعد ذلك ، التقط صورا للخلايا المركبة في أماكن مختلفة على العينات باستخدام مجهر مضان مقلوب بتكبير 10 × باستخدام مكعبات الترشيح المناسبة. افتح الصور في الصورة J.قم بتقسيم الصور إلى قنوات فردية.

قم بتحويلها إلى ثمانية عطاءات. اطرح الخلفية وتنعيمها عن طريق التصفية المتوسطة. ثم اضبط العتبة يدويا لتسليط الضوء على المسام وأجسام الخلايا والنوى.

استخدم الأمر مستجمعات المياه لفصل المسام أو الخلايا المدمجة. قم بتعيين معلمات تحليل الجسيمات وتنفيذ الأمر لاستخراج عدد الجسيمات ومتوسط المساحة والنسبة المئوية للتغطية بواسطة الجسيمات. أخيرا ، قم بتعديل ملفات الماكرو المضمنة لإجراء تحليل دفعي لصور متعددة.

عرض تغيير لون الأنماط المعدنية المترسبة قبل وبعد صناعة السبائك d. يرجع التشطيب الفضي إلى محتوى سبائك الفضة الغنية على صناعة السبائك. يكتسب الفيلم لونا بنيا برتقاليا واضحا.

تظهر هنا الميزات الدقيقة التي تنتجها الطباعة الحجرية للصور. زخرفة المعدن. يمكن الحصول على أشكال سيئة مختلفة عن طريق المعالجة الحرارية لأغشية الذهب المسامية النانوية.

تكشف صورة المقطع العرضي ما إذا كانت الأغشية مزينة بالسبائك بشكل موحد من خلال سمك الفيلم. يمكن تقسيم صور المجهر الإلكتروني الماسح إلى صور ثنائية لتحديد الحجم والنسبة المئوية للتغطية بواسطة الفراغات. يمكن تنزيل التعليمات البرمجية لإنشاء هذا الإخراج من صفحة الويب الخاصة ب JoVE.

تصوير صورة مضان تمثيلية لخلايا الخلايا النجمية الملتصقة في الفئران المزروعة على سطح ذهبي مسامي نانوي هنا. يمكن تقسيم القنوات الفردية للصورة وتقسيمها لإنتاج صور ثنائية لتحليل تفاعل مادة الخلية. يمكن استخدام صور الهيكل الخلوي المجزأة لتحديد مساحة الخلية وتغطية السطح.

في حين أن صور النواة الخلوية المجزأة مفيدة لعد الخلايا. يمكن تنزيل الرموز اللازمة لإنشاء هذه المخرجات من صفحة الويب الخاصة ب JoVE. يظهر هنا ملخص مرئي للفشل في تصنيع هياكل الذهب المسامية النانوية ، بما في ذلك التصاق فيلم PO ، وغياب المسامية ، والمعالجة الحرارية المفرطة.

باتباع هذا الإجراء ، تقترح طرق أخرى التوصيف الكهروكيميائي في الفحص المجهري للغابات ، وتحلل الخلايا ، ويمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للإجابة بشكل أكبر على أسئلة إضافية مثل تأثير التصاق الخلايا ذات البنية النانوية والتعبير الجيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج أنماط الذهب المسام النانوية وتحديد تفاعلاتها مع الخلايا عن طريق تحليل الصور الرقمية للفحص المجهري. النتائج. لا تنس أن العمل مع حمض النيتريك وحمض الكبريت وبيروكسيد الهيدروجين يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات بما في ذلك زراعة معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.