إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير ركيزة ذات نمط ثنائي الأبعاد للتحكم في امتصاص البروتين ونمو الخلايا. ويتم تحقيق ذلك باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية لتصنيع قالب أساسي منقوش، والذي يُستخدم لإنتاج طابع A-P-D-M-S للطباعة بالتلامس الدقيق. وفي خطوة ثانية، يتم تحضير الركيزة الذهبية المنقوشة، والتي تتضمن عملية الطباعة بالتلامس الدقيق لإنتاج نمط يحتوي على مناطق تمتص البروتين وأخرى تقاومه.

بعد ذلك، تُضاف البروتينات والخلايا إلى الركيزة من أجل تصور النمط ودراسته. وتُستخلص نتائج نمو الخلايا وسلوكها التي تظهر حبساً جيداً للبروتينات والخلايا على هذه الركائز ذات الأنماط، وذلك بناءً على مجهر الفلورسنت ومجهر تباين الطور. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل طباعة MicroCon للبروتينات، في أن الطبقة الأحادية المنتهية بالجليكول تمنع الامتصاص غير النوعي للبروتينات والخلايا في خلفية النمط.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تقنية الختم الصحيحة يجب أن يتم تحسينها لكل نمط مطبوع. لبدء تحضير مركز القالب المنقوش، يتم وضع رقاقة السيليكون على جهاز الطلاء الدوراني، وخلال الخطوة الأولى من برنامج الدوران المكون من دورتين، تُشطف الرقاقة بالأسيتون. وخلال الخطوة الثانية من برنامج الدوران، سيتبخر الأسيتون تاركاً الرقاقة نظيفة وجافة؛ وفي بداية عملية الدوران، يتم وضع المادة المقاومة للضوء على الرقاقة ثم يتم طلاؤها دورانياً باستخدام الظروف الموصوفة سابقاً.

قم بإجراء الخبز اللين للرقاقة المطلية بالمقاوم الضوئي عند 110 °C لمدة دقيقتين باستخدام لوح تسخين عالي التجانس. بعد ذلك، قم بعمل النمط الضوئي للرقاقة المطلية بالمقاوم الضوئي باستخدام نظام محاذاة الأقنعة وقناع مناسب.

أولاً، ضع الركيزة على منصة التفريغ الخاصة بجهاز محاذاة القناع. ثم أدخل القناع في صينية الحامل وشغل نظام التفريغ لتثبيت القناع في مكانه لضمان التلامس الجيد بين القناع والركيزة. ارفع الركيزة حتى تلتقي بالقناع.

استخدم البصريات الخاصة بجهاز المحاذاة للتأكد من تحقيق تلامس جيد. وأخيراً، قم بتشغيل المصباح لتعريض الركيزة للضوء فوق البنفسجي UV من خلال القناع الليثوغرافي. قم بتظهير الرقاقة المنقوشة في محلول المظهر لمدة دقيقة واحدة و45 ثانية مع التقليب اللطيف.

اشطف جيداً بماء منزوع الأيونات من درجة أشباه الموصلات، وجفف بتيار من غاز النيتروجين، وتحقق من تطوير النمط باستخدام مجهر مزود بمرشح UV. ابدأ هذا الإجراء بتحضير خليط من الراتنج والمصلب بنسبة 10 إلى 1 من حيث الوزن. اخلط cigar 180 2 بشكل كامل.

قم بتغطية الرقاقة ذات النمط الصوري بالخليط في طبق بيتري مخصص للاستخدام مرة واحدة داخل مجفف فراغي. قم بتفريغ الهواء من القالب المغطى بـ PDMS حتى تختفي جميع الفقاعات المرئية. بعد التأكد من استقرار القالب في قاع الطبق، اترك الختم ليتصلب في فرن عند 65 °C لمدة 1.5 ساعة. وبمجرد تصلب ختم PDMS، قم بقصه من القالب وتشذيبه إلى الحجم المناسب.

قم بتخزين الختم في حاوية مغطاة بحيث يكون الجانب المميز متجهًا للأعلى لحمايته من الغبار والرواسب. ولتحضير الركائز لترسيب المعادن، ابدأ بمعالجة شرائح التغطية الزجاجية المستديرة ببلازما الأكسجين لمدة 10 دقائق. ثم اشطف شرائح التغطية مرتين بالماء منزوع الأيونات مع التجفيف بتيار من غاز النيتروجين بين عمليات الشطف؛ وبعد الشطف بالماء، اشطفها مرتين بالإيثانول مع التجفيف مرة أخرى بتيار من غاز النيتروجين بين عمليات الشطف.

باستخدام نظام ترسيب الحزمة الإلكترونية متعدد الجيوب، يتم ترسيب 50 angstroms من التيتانيوم يليه 150 angstroms من الذهب. لا تقم بتفريغ المبخر بين ترسيب طبقة التيتانيوم وطبقة الذهب. اشطف ختم PDMS باستخدام الإيثانول وجففه جيداً.

باستخدام غاز النيتروجين، يتم وضع محلول الختم على الختم قطرة تلو الأخرى حتى يتم تغطيته بالكامل. جفف الختم جيداً باستخدام غاز النيتروجين. تعتمد عملية الطباعة بالتلامس الدقيق لملف HEXA Decane على خصائص ختم PDMS، وتعد واحدة من أصعب جوانب هذا الإجراء.

يتطلب الختم الناجح تطوير تقنية جيدة تضمن تطبيق ضغط متساوٍ. وأثناء عملية الختم، وفي حالة الطباعة المجهرية التلامسية التقليدية في الهواء، اضغط بلطف على الختم فوق الركيزة الذهبية واترك الطبقة الأحادية تتشكل لمدة 15 ثانية.

وبدلاً من ذلك، بالنسبة للأنماط التي تتكون من ميزات صغيرة جداً ونسب باعية عالية، ضع الركيزة الذهبية في طبق بتري يحتوي على ماء منزوع الأيونات بمقاومة 18.2 mega ohm، مع التأكد من غمر الركيزة. ثم اضغط الختم برفق على الركيزة الذهبية واترك الطبقة الأحادية تتشكل لمدة 15 ثانية. بعد ذلك، اشطف الركيزة المختومة مرتين باستخدام الإيثانول ثم جففها بغاز النيتروجين.

بعد كل عملية شطف، ضع الركيزة في طبق بيتري وغطِّ الركيزة بمحلول ملء الخلفية. أحكم إغلاق الطبق باستخدام param لمنع التبخر. اترك الطبقة الأحادية للخلفية لتتشكل في الظلام لمدة تتراوح من 12 إلى 14 ساعة.

أخيرًا، قم بإزالة شريحة الغطاء المنقوشة من محلول الملء الخلفي واشطفها مرتين بالإيثانول مع التجفيف بغاز النيتروجين بعد كل شطفة. لتطبيق البروتين على شريحة الغطاء المنقوشة، ضع الشريحة إما في طبق بتري صغير أو في حجرة زراعة الخلايا. غطِ الشريحة بـ 500 µL إلى 1 mL من محلول DPBS. يجب أن يغطي DPBS الركيزة تمامًا أثناء تحضين البروتين.

لضمان تغطية بروتينية متساوية، أضف محلولاً مركزاً من البروتين إلى DPBS واخلط المحلول عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات. حضّن خليط البروتين مع الركيزة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، اشطف الركيزة جيداً باستخدام DPBS لإزالة البروتين غير المرتبط، مع الحرص على عدم تجفيف الركيزة أو تعريضها للسطح البيني بين الهواء والماء.

بعد ثلاث غسلات، قم بشفط DPBS. ثم أضف ما يقرب من 500 microliters من وسط نمو الخلايا الكامل للحفاظ على رطوبة الركيزة. استبدل وسط النمو المستخدم لشطف الركيزة.

باستخدام أوساط زراعية طازجة، تصبح الركيزة الآن جاهزة لزراعة الخلايا. عادةً ما يتم زراعة من 30 إلى 200 خلية لكل مليمتر مربع على الركيزة. تُظهر هذه الصورة ختم A-P-D-M-S كما يظهر تحت المجهر عن طريق وضع جانب ميزة الختم لأسفل على شريحة زجاجية غطائية، وشريط المقياس هو 100 micrometers.

يؤدي الختم الصحيح إلى الحصول على نمط بروتيني حاد وواضح يمكن رؤيته من خلال تطبيق بروتين مُوسوم فلوروسنتياً، مثل fibronectin المُوسوم بـ LOR 6 47. يظهر هنا حصر خلايا chk one ضمن النمط البروتيني. تمثل أشرطة المقياس 100 micrometers في هذه الصور.

بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الكيمياء النسيجية المناعية لتصوير نمط البروتين بعد التثبيت باستخدام SU. هنا، يتم استخدام جسم مضاد لـ laminate مقترن بـ LOR three 50 لتصوير laminate منمّط تمت زراعة عصبونات حُصين فأر في اليوم الجنيني E 18 عليه، كما يظهر بعد أربعة أيام في المختبر. وتظهر عصبونات حُصين فأر E 18 المصبوغة بـ MIT tracker red five 80 أن نمو الخلايا محصور بدقة ضمن نمط البروتين. ورغم أن هذه التقنية يمكن إتقانها بسهولة، إلا أنه قد تظهر عدة مشكلات شائعة كما هو موضح في تحضيرات الركيزة المنمّطة هذه التي تم تصويرها عبر امتصاص fibronectin المقترن بـ LOR 6 47.

يمكن أن يؤدي تطبيق البروتين دون خلط كافٍ لمحلول البروتين المركز في DPBS إلى ظهور أنماط بروتينية غير متجانسة. كما قد يؤدي الختم غير الصحيح إلى نقل جزئي للنمط أو انهيار الختم. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعريض ركيزة النمط التي تحتوي على البروتين الممتص للهواء قد يؤدي إلى تعطيل الطبقة الأحادية، مما يتسبب في انخفاض المقاومة.

في الخلفية، يمكن أن ينتج التنميط المغمور أنماطاً ذات سمات صغيرة يصعب طباعتها بواسطة الطباعة الدقيقة بالتلامس التقليدية وفي الهواء. تُظهر هاتان الصورتان مناطق مختلفة من نفس النمط المطبوع باستخدام نفس ختم PDMS في الهواء أو في الماء منزوع الأيونات؛ وتظهر خطوط الدعم في الصورة الموجودة على اليسار لتوضيح أن السمات الصغيرة فقط من النمط هي التي فشلت في الطباعة بنجاح. أشرطة المقياس هي 20 micrometers. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 18 إلى 24 ساعة إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تصنيع ركيزة ذات نمط محدد. قم بتصنيع ختم من A-P-D-M-S. استخدم الطباعة بالتلامس الدقيق لتحضير ركيزة ذهبية ذات نمط محدد، وقم بتصوير هذا النمط باستخدام البروتينات والخلايا.