الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق تقنيات البصريات الوراثية الحديثة لتحفيز المسارات العصبية المستهدفة بالصور في مستحضرات الشرائح في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن قضيب القناة Dossin في خطوط الخلايا العصبية ذات الأهمية. الخطوة الثانية من الإجراء هي إجراء مستحضرات شريحة حادة لهياكل الدماغ ذات الصلة المراد دراستها.

الخطوة التالية هي تسجيل الاستجابات من الخلايا العصبية في تحضير الشريحة استجابة للتحفيز الضوئي للقناة ، حيث يعبر قضيب دوسين عن الألياف. الخطوة الأخيرة هي تصوير توزيع قناة opsin التي تعبر عن الخلايا العصبية والألياف. في النهاية ، يتيح هذا النهج تقييم التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية للدوائر العصبية باستخدام تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر للمكونات العصبية المستهدفة بصريا.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على طرق التحفيز الكهربائي التقليدية في القدرة على استهداف وتحفيز أنواع معينة من الخلايا العصبية على وجه التحديد وفحص إسقاطاتها بعيدة المدى في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب للأنظمة ، مثل التنظيم الوظيفي لمآخذ الحرب المعقدة. قم بإعداد حقنة وإبرة لحقن المحلول الفيروسي الذي يحتوي على أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من البولي لتعزيز التعداد.

ثم حقن الضغط 200 نانولتر من المحلول باستخدام مضخة المحقنة ، بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، سيكون هناك تعبير كاف عن شريحة دوسين قضيب القناة. يجب إجراء التحضير في أسرع وقت ممكن بعد إزالة الدماغ المحقون ، قم بعمل كتلة من الدماغ في الاتجاه المطلوب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك ، قم بلصق السطح المسدود للدماغ على مرحلة القطع باستخدام غراء لاصق فوري.

ثم انقل المرحلة إلى غرفة قطع الاهتزاز المبردة بالفريزر واسكب السائل الدماغي النخاعي المثلج في غرفة التقطيع. قم بتقطيع أقسام الدماغ باستخدام فيوم إلى أقسام بسمك أربعة إلى 500 ميكرون. انقل شرائح الدماغ إلى غرفة احتجاز مؤكسجة واتركها تحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الشروع في التجربة.

عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، انقل شريحة الدماغ إلى مرحلة جهاز التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. سجل خلية عصبية باستخدام تقنيات مشبك رقعة الخلية الكاملة القياسية. ضع ماصة التسجيل بجانب الخلية العصبية لفترة وجيزة أثناء الضغط الإيجابي على الماصة.

بعد التلامس مع الخلية ، حرر الضغط وقم بتطبيق الشفط لتشكيل ختم الجيجا. ثم قم بتطبيق شفط قصير لكسر الغشاء لتكوين الخلية بأكملها والتقاط التسجيلات في أوضاع الجهد أو المشبك الحالي. قم بتشغيل الماسح الضوئي بالليزر إما باستخدام موجة المد والجزر أو برنامج الحصول على بيانات EFAs.

يجب معايرة البرنامج على الصمام الثنائي للصور قبل استخدامه للتحكم في قوة الليزر. يتم وضع عجلة متغيرة الكثافة المحايدة في مسارها يؤدي تدوير العجلة إلى ضبط قوة الليزر عن طريق القياس في المستوى البؤري الخلفي.

عادة ما يتم ضبط الطاقة على ما بين 25 و D مللي واط. تتحكم معلمة النبض في الغالق في طول وتوقيت التحفيز في البرنامج. يمكن عمل صورة للمنطقة المراد تحفيزها من وظيفة الاستيلاء على الفيديو.

بعد ذلك ، قم بتعيين شبكة التحفيز مثل شبكة 16 × 16 مع تباعد 80 ميكرون. ثم قم بتراكب الشبكة على الصورة المكتسبة واضبط إحداثيات XY ودرجة الإزاحة لتحسين الاتجاه لبدء التحفيز. قم بتنشيط وظيفة الخريطة.

يتم الاحتفاظ بالبيانات ويمكن تحليلها باستخدام برنامج التحليل غير المتصل بالإنترنت في موجة المد والجزر ، أو يمكن تحليلها باستخدام برنامج تحليل الخريطة في برنامج EFAs. بعد الانتهاء من التسجيلات الفسيولوجية على الشريحة ، يمكن توثيق نمط التعبير عن opsin القناة الموسومة YFP. أولا ، قم بإصلاح الشريحة طوال الليل في 4٪ PFA في 0.01 مولار PBS عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، انقل الشريحة إلى محلول 30٪ سكروز 4٪ PFA لحماية التبريد طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقص 50 ميكرون من الشريحة على ناظم البرد. اشطف الشرائح في PBS وقم بتثبيتها للتصوير باستخدام وسيط مضاد للبهتان في المجهر متحد البؤر.

بعد العثور على منطقة الاهتمام في الضوء الأبيض ، استخدم طولا موجيا مثيرا يبلغ 514 نانومترا وطولا موجيا للانبعاث 527 نانومتر. لتصوير البنية الفيروسية YFPA التي تقود التعبير عن قضيب القناة دوبسون ، EYFP. في الخلايا العصبية الجلوتاماتية المثيرة تم حقنها في القشرة البصرية الأولية لفأر BSY.

تم العثور على التعبير الفيروسي في المسارات بين القشرة البصرية الأولية والثانوية ، وفي ألياف المهاد القشرية لتسجيل مشبك تصحيح الخلية الكاملة LGN من خلية عصبية في القشرة البصرية الثانوية التي تميزها النجم عن e PSCs. بعد تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر للقناة ، يعبر قضيب دوسين عن الألياف في الطبقات السفلية من V اثنين من إسقاطات المهاد القشرية من الطبقة السادسة من القشرة الحسية الجسدية الأولية. تمت دراسة النواة الخلفية البطنية باستخدام نهج CRE LAX للتعبير عن قضيب القناة dossin في الخلايا العصبية المهادية القشرية السادسة ، وفي إسقاطاتها كما هو متوقع ، أدى التعدي من قبل بناء A A V في فأر معدل وراثيا CRE إلى تعبير قضيب القناة في الطبقة المستهدفة الستة من الخلايا العصبية وأليافها الممتدة إلى الطبقة الرابعة.

قضيب القناة دوبسون ، لوحظ تعبير EYFP أيضا في الألياف التي تسقط على التسجيلات الفسيولوجية VP من خلية عصبية VP. كشف استخدام مشبك تصحيح الخلية بالكامل أنه يمكن استنباط e PSCs بعد التحفيز الضوئي بالقرب من الخلايا العصبية المسجلة ، والتي تتميز بالنجم. يصور التحليل غير المتصل بالإنترنت متوسط سعة الاستجابة لتحفيز الصورة في VP تم استئصال شرائح 50 ميكرون من الخلايا العصبية المهادية القشرية السادسة التي تعبر عن قناة Rodin EYFP كشفت عن نمط دقيق من الألياف المصنفة التي تعبر من الطبقة السادسة إلى الطبقة الرابعة حيث تنتهي وشجرة على نطاق واسع.

بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت ألياف المهاد القشرية تدخل المادة البيضاء وتعبر نحو المهاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق تقنيات البصريات الوراثية الحديثة لتحفيز الصور على المسارات العصبية المستهدفة في مستحضرات الشرائح في المختبر. لا تنس أن العمل باستخدام الليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية عند تنفيذ خطوات المعايرة المرتبطة بهذا الإجراء.

ارتد نظارات واقية.