رسم الدوائر العصبية المثبطة بواسطة المسح الضوئي ليزر ضوئي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء التنظيم الوظيفي المحلي للدوائر العصبية المثبطة. يبدأ الإجراء بتحضير شرائح دماغية حية من القشرة الحسية الجسدية الأولية للفئران. وتتمثل الخطوة التالية في تصوير وتسجيل النشاط من أنواع الخلايا المثبطة المستهدفة التي تعبر عن GFP في الشريحة الدماغية.

بعد التحفيز الضوئي بمسح الليزر عبر الغلوتامات، يتم استخدام فك القفص الجزيئي (uncaging) لتنشيط مجموعات صغيرة من العصبونات قبل التشابكية كعصبونات استثارة أو تثبيط. تُسجل التيارات بعد التشابكية في العصبونات البينية التي تعبر عن GFP. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء التحفيز الضوئي وتحليل البيانات، ثم إنشاء خرائط كمية للمدخلات التشابكية للعصبونات المسجلة.

في نهاية المطاف، يتيح التحفيز الضوئي بالمسح الليزريي مدمجاً مع تسجيلات الخلية الكاملة بناء خرائط تفصيلية للمدخلات المشبكية لأنواع محددة من العصبونات المثبطة، مما قد يسمح بتحديد تنظيم ووظيفة الدوائر القشرية المثبطة المحلية. وقد ابتكر هذه التقنية القائمة على التحفيز الضوئي الدكتور Larry Katz ونيد Calloway، وطورها لاحقاً الدكتور Carols Waboda، كما تدرب المشرف على بحثي الدكتور Xing Z مع الدكتور Calloway في معهد Salk، حيث قاد العديد من الدراسات التي تبحث في الدوائر البينية. وتقوم مجموعتنا حالياً بتوسيع ومواصلة هذه الدراسات للبحث في الدوائر البينية.

لبدء هذا الإجراء، يتم التضحية بفأر معدل وراثياً في الأسبوع الثاني إلى الثالث بعد الولادة عن طريق فصل الرأس، وإزالة الدماغ بسرعة، ثم وضع الدماغ في محلول تقطيع مجمد ومؤكسج. بعد ذلك، تُستخدم نظارات GFP لفحص الدماغ بصرياً والتحقق من تعبير GFP. تالياً، يتم تقطيع القشرة الحسية الجسدية الأولية إلى مقاطع بسمك 400 micrometer باستخدام جهاز التقطيع الاهتزازي.

قم بحضن الشرائح في A CSF المحتوي على السكروز والمشبع بـ 95%O2 و 5%CO2 عند درجة حرارة 32 درجة مئوية لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك، انقل الشرائح إلى A CSF العادي في درجة حرارة الغرفة أثناء تجهيز الليزر للتجربة، وقم بتشغيل نظام تبريد الليزر ووحدة تزويد الطاقة. ثم قم بتشغيل جميع الأجهزة المتعلقة بالتحكم في التحفيز الضوئي، بما في ذلك نظام مرآة المسح، والمعدل البصري، والغالق الإلكتروني، ومضخم إدخال الثنائي الضوئي.

بعد ذلك، قم بتشغيل معدات الفيزيولوجيا الكهربائية مثل مضخم الإشارة multi clamp 700 B والمناورات الدقيقة. تُجرى التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية والتحفيز الضوئي والتصوير في غرفة تروية الشرائح المثبتة على المنصة الآلية للمجهر. بعد ذلك، قم بتشغيل كاميرا التصوير، حيث سيتم تصوير الشريحة باستخدام المجهر القائم المزود ببصريات DIC بالأشعة تحت الحمراء وبصريات الفلورية فوق البنفسجية (epi fluorescent) من خلال نظام التصوير.

بعد ذلك، افتح برنامج FS القائم على MATLAB وبرنامج كاميرا Q capture على الشاشة. وقبل البدء في التجربة، افحص نظام التحفيز الضوئي بالليزر للتأكد من أنه في حالة تشغيلية. ضع ورقة تحت عدسة المجهر بقوة تكبير 4x لمراقبة نمط مسح الليزر أثناء تشغيل النظام.

لصنع القطب الكهربائي الدقيق بمقاومة تتراوح بين 4 إلى 6 mega Ω، اسحب قطباً زجاجياً باستخدام جهاز سحب الماصات. ثم املأ القطب بمحلول داخلي يحتوي على 0.1% biotin لوسم الخلايا والتعرف المورفولوجي. بعد ذلك، قم بتشغيل نظام التروية المضغوط لضخ A CSF إلى الحجرة.

تأكد من الحفاظ على مستوى سائل ثابت بمقدار 2.0 millimeters فوق الشريحة في الغرفة. تُضاف كمية محددة من المحلول المخزون لـ MNI caged glutamate إلى 25 milliliters من A CSF المتدفق لتحقيق تركيز 0.2 millimolar من caged glutamate. بعد ذلك، انقل شريحة دماغية واحدة إلى غرفة التسجيل.

قم بتشغيل نظام التصوير للتحقق من جودة الشريحة وتحديد الموقع التشريحي للمنطقة الحسية الجسدية الأولية. بعد ذلك، قم بتثبيت الشريحة باستخدام حلقة بلاتينية خيطية مصنوعة خصيصاً، مع الحرص على عدم وضع المثبت فوق منطقة الدماغ المخصصة للتسجيل. قم بمعاينة الخلايا باستخدام عدسة شيئية 60 x بناءً على رؤية تعبير GFP تحت مجهر DIC الفلوري.

حدد أنواع الخلايا المثبطة واخترها. يرجى ملاحظة أن التسجيل سيتم تحت تحكم بصري بمساعدة تقنية DIC بالأشعة تحت الحمراء. يعد الرصد بالفيديو والتبديل بين وضعي DIC والفلورة أمراً ضرورياً لتأكيد موقع خلية GFP أثناء خفض القطب الكهربائي وصولاً إلى الخلية المستهدفة.

باستخدام تقنية تثبيت الرقعة التقليدية. أولاً، يتم تطبيق ضغط إيجابي على القطب الكهربائي. ثم يتم تحريكه ليقترب من سطح الخلية لإنشاء انبعاج ملحوظ على غشاء الخلية المستهدفة.

ثم يتم تطبيق ضغط سلبي بسرعة لتكوين ختم جيجا (giga seal) واختراق غشاء الخلية مع مراقبة استجابات حقن التيار على شاشة الفيديو. وعند حدوث الاختراق، يتم التقاط صور للعصبون الداخلي الذي يعبر عن GFP المسجل بتكبير 60x تحت وضعي DIC والفلورية للتحقق عبر الإنترنت. وقبل جمع بيانات التحفيز الضوئي، يتم حقن نبضات تيار مفرطة الاستقطاب ومزيلة للاستقطاب لفحص الخصائص الفيزيولوجية الكهربائية الأساسية لكل خلية.

بمجرد استقرار التسجيل من الخلية الكاملة وتحقيق مقاومة وصول جيدة، والتي تكون عادةً أقل من 20 mega ohms، قم بتبديل عدسة المجهر من تكبير 60 x إلى تكبير 4 x من أجل التحفيز الضوئي بالمسح الليزري، ثم التقط صورة للشريحة بتكبير 4 x واستخدمها لتوجيه وتسجيل مواقع التحفيز الضوئي. قم بضبط معلمات التحفيز الضوئي واقتناء البيانات عن طريق تفعيل وحدة مفتاح التكوين في phys. استخدم نبضة ليزر مدتها 1 millisecond وبقدرة 20 milliwatts تقريباً مع فاصل زمني للتحفيز قدره 1 second.

بالنسبة لرسم خرائط التحفيز الضوئي، يتم الحصول على آثار البيانات لمدة ثانية واحدة بمعدل أخذ عينات يبلغ 10 kilohertz. بعد ذلك، يتم تحميل صورة المقطع العرضي الرباعية في وحدة رسم الخرائط ببرنامج phys. حدد موقع soma وقم بإعداد مواقع التحفيز الضوئي بنمط 16 في 16 وبأبعاد 80 µm في 80 µm.

المسافات حول موقع الخلية، والتي تغطي جميع الطبقات القشرية. ثم قم برسم مخطط ملف الاستثارة للعصبون المسجل من خلال فحص مواقع نبضات الجهد استجابةً للتحفيز الضوئي في وضع تثبيت التيار. يسهل برنامجنا سهل الاستخدام والمزود بميزات العرض المباشر تجارب رسم الخرائط هذه.

بعد ذلك، قم برسم خرائط اتصالات الدائرة الاستثارية المحلية عن طريق الكشف عن التيارات الاستثارية بعد المشبكية من الخلية المسجلة. باستخدام المسح بالليزر في مواقع مختلفة، حافظ على الخلية عند -70 millivolts في وضع تثبيت الجهد للكشف عن التيارات الاستثارية الداخلة. ثم كرر خرائط التيارات الاستثارية بعد المشبكية من مرتين إلى ثلاث مرات مع تدوير أو عكس نمط التحفيز الضوئي. ولرسم خرائط اتصالات الدائرة التثبيطية المحلية، قم بالكشف عن التيارات التثبيطية بعد المشبكية من الخلية المسجلة.

حافظ على جهد الخلية عند قيمة قريبة من صفر millivolts في هذه الحالة، وتحديداً negative 15 millivolts في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp mode) من أجل الكشف عن التيارات التثبيطية الخارجة. وبعد الانتهاء من جميع المقاييس الفسيولوجية، قم بإزالة القطب الكهربائي برفق من الخلية التي تم تسجيلها. ثم أخرج شريحة الدماغ من الغرفة، وقم بتثبيتها في 4% para formaldehyde طوال الليل، ثم صبغ الخلايا المسجلة ضد biotin.

في هذه التجربة، يتم استخدام مزيج من تعبير GFP، والفيزيولوجيا الكهربائية الجوهرية، والخصائص المورفولوجية لتصنيف العصبونات المثبطة. موضح هنا مثال وخريطة بيانات خام لتوضيح التحفيز الضوئي بالمسح الليزري، والذي يسمح برسم خرائط واسعة لاتصالات الدوائر القشرية المحلية بالعصبون المثبط المسجل. وهذه أمثلة لخرائط المدخلات الكمية المرمزة بالألوان والمستمدة من الآثار الخام الموضحة للتو في الشكل D. تم ترميز سعات الأحداث التشابكية المكتشفة في العصبون البيني المسجل بالألوان وتم تراكبها طبوغرافياً على مواقع التحفيز الضوئي.

يُشار إلى موقع جسم الخلية بالدائرة الحمراء المفتوحة في شريط المقياس. وتشير الألوان الدافئة إلى مدخلات مشبكية قوية، بينما تشير الألوان الباردة إلى اتصال ضعيف أو عدم وجود اتصال بالخلية المستهدفة. وبالمثل، يوضح الشكل E عدد الأحداث المشبكية لكل موقع فك تقييد تم أخذ عينة منه بالنسبة للعصبون المُسجل.

يوضح الشكل F وقت بدء أول حدث مشبكي تم رصده في الخلية المسجلة بعد التحفيز الضوئي وفقاً لشريط المقياس. تشير الألوان الدافئة إلى مدخلات قصيرة زمنياً (كمون منخفض)، بينما تشير الألوان الباردة إلى كمونات مشبكية أطول. وبذلك، يتيح نظام LSPS بناء خرائط تفصيلية لمواقع وقوة وكمون وعدد المدخلات التي تؤثر على أنواع محددة من العصبونات المثبطة.

حسنًا، عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التحلي بالصبر، وتهيئة ظروف تجريبية نظيفة، والتعامل مع العصبونات بفعالية وحذر شديد عند الانتقال من التكبير العالي إلى التكبير المنخفض. ثم في النهاية، استخدام برنامج التحليل بشكل جيد.