عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل قطرات الدهون من الأنسجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح أنسجة المشيمة وفصلها أولا. بعد ذلك ، يتم تجانس خلايا الأولين.

ثم يتم فصل العضيات بعدة خطوات للطرد المركزي. أخيرا ، يتم جمع الطبقة العائمة التي تحتوي على قطرات الدهون وتمييز قطرات الدهون. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري وتحليل الدم الغربي لإظهار نقاء جزء قطرات الدهون.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من الممكن عزل قطرات الدهون من معظم خلايا الأبهر. لاحظ أنه في بعض الأنسجة ، يمكن أن يكون عدد القطرات أقل من تلك التي تقلل من طبقة G العائمة وعدد القطرات. تم جمع المشيمة من النساء الأصحاء ذوات الحمل الفردي اللواتي يخضعن للولادة القيصرية الاختيارية قبل بداية المخاض التلقائي عند الولادة الناضجة ، وأعطى الأشخاص موافقة خطية مستنيرة على جمع المشيمة.

تم جمع المشيمة واستخدامها لاحقا بموافقة من جامعة تينيسي وكلية الدراسات العليا للطب بجامعة تينيسي في نوكسفيل. لوحة المراجعة المؤسسية في غطاء السلامة البيولوجية ، ونقل المشيمة إلى حاوية معقمة قابلة للتعقيم وغسل الدم بعناية من المشيمة والأغشية باستخدام محلول ملحي معقم. تخلص من المحلول الملحي الدموي في دورق سعة لتر واحد كنفايات بيولوجية سائلة.

ضع المشيمة على حقل معقم مع هذا السطح الأملس الذي يحمل الحبل السري متجها لأعلى بمقص وملقط حاد ودقيق. إزالة الحبل السري وأغشية الجنين. بعد ذلك ، اقلب المشيمة بحيث يكون سطح الأم متجها لأعلى.

ثم قم بإزالة أنسجة الصفيحة القاعدية المغطى على بعد حوالي ثلاثة ملليمترات من السطح. قم بتشريح رصاص COTA واحد في كل مرة ، وتجنب الصفيحة المشيمية ، واجمع الأنسجة الزغبية في دورق سعة 250 مليلتر مع محلول ملحي. ثم استخدم محلول ملحي معقم 0.9٪ وملقط لشطف الأنسجة عدة مرات في دورق منفصل عن طريق التدوير باستخدام دورق سعة لتر واحد للنفايات السائلة.

انقل رصاصة كودي واحدة في كل مرة إلى طبق بتري 150 ملم. امسك بالملقط واستخدم شفرة حلاقة لكشط الأنسجة من الأوعية الدموية على طبق بتري. ضع الأنسجة المكشطة في دورق منفصل يحتوي على محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪.

كرر مع جميع قطع المناديل. بعد شطف الأنسجة المكشطة في تفكك الخلايا cve ، قم بتصريفها من السوائل الزائدة والوزن لهضم أنسجة المشيمة. بعد تحضير خليط هضم الأنسجة ، قسم الأنسجة التي تنقل 60 جراما من إجمالي الأنسجة التي تم جمعها إلى قارورة هيلين ماير المعقمة سعة 500 مل.

أضف خليط هضم الأنسجة إلى القارورة التي تحتوي على الأنسجة واحتضنه عند 37 درجة مئوية في شاكر لمدة 45 دقيقة. عند 150 دورة في الدقيقة لجمع الخلايا المنفصلة بعد الحضانة وإمالة القارورة للسماح للأنسجة بالاستقرار. اجمع السوبر ناتين.

الحرص على عدم جمع الأنسجة المنفصلة UND. أضف كمية متساوية من HBSS إلى المادة الطافية قبل نقلها إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل. كرر التفكك وجمع المواد الطافية مع الأجزاء المتبقية من الأنسجة المرتبطة ب UND لكل دفعة بعد الطرد المركزي عند 1000 مرة.

الجاذبية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية شفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. توجد خلايا الزغابات المشيمية في الغالب في الجزء الأبيض من الحبيبات التي تغطي خلايا الدم الحمراء. انقل خلايا الزغابات في الجزء الأبيض من الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مليلتر واحتفظ به على الجليد.

بعد جمع الخلايا من جميع مراحل الهضم الثلاث ، استخدم مصفاة خلية نايلون 100 ميكرون يتم إدخالها في الجزء العلوي من أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 50 مليلتر لتصفية التعليق. إذا تباطأ ترشيح تعليق الخلية ، ارفع لأعلى على المرشح لسحب فراغ داخل جهاز الطرد المركزي الأنبوبي عند أربع درجات مئوية و 1000 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات لتجانس خلايا الزغابات المشيمية باستخدام وسط تحلل ناقص التوتر المحضر حديثا أو HLM في غطاء أمان بيولوجي ، أضف أربعة أضعاف حجم حبيبات الخلية من HLM البارد إلى الخلايا.

استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لإعادة التدوير برفق وبدقة. قم بتعليق الخلايا عن طريق سحب ماصاتها لأعلى ولأسفل. بعد احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، انقلها إلى الخالط البارد المثلج وقم بتجانس الخلايا ببطء باستخدام المدقة الفضفاضة عن طريق تطبيق 20 إلى 25 ضربة لطيفة.

قم بتدوير المحللة عند 3000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا غير المنقطعة. ثم اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد قبل الدوران مرة أخرى عند 25،000 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. لإزالة الميتوكوندريا لعزل قطرات الدهون عن طريق الطرد المركزي الفائق ، اجمع السوبر ناتين في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.

اضبط على 20٪ من السكروز وانقله إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق لدوار S SW 28 أو تراكب مكافئ للسوبر ناتين المعدل بالكثافة مع حوالي 10 ملليلتر من البرد المثلج ، و 100 ملليمولار من كربونات الصوديوم العازلة و 0.5 إلى مليلتر واحد من HLM المثلج البارد لملء الأنبوب باستخدام جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح S SW 28 عند 130 ، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم اجمع الطبقة العائمة ، واضبطها على 10٪ سكروز وانقلها إلى قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق سعة 13.2 مليلتر لدوار SW 41 TI أو ما يعادله من التراكب الطافي المعدل الكثافة مع حوالي خمسة ملليلتر من البرد الجليدي ، و 100 مللي مولار من كربونات الصوديوم و 0.5 مل من HLM البارد المثلج بعد الطرد المركزي عند 274 ، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. في دوار SW 41 TI، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لتجميع الطبقة العائمة العلوية التي تحتوي على قطرات دهنية بعناية.

اضبط الحجم على 10٪ سكروز وانقله مرة أخرى إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 13.2 مليلتر قبل التراكب بخمسة ملليلتر من البرد المثلج و 100 ملليمولار من كربونات الصوديوم و 0.5 مل من HLM البارد. بعد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة ، استخدم ماصة PE مثنية لتجميع الطبقة العائمة العلوية ذات اللون الأبيض التي تحتوي على قطرات الدهون بعناية في ثلاثة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولتر من HLM. قم بتمييز قطرات الدهون وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح في هذا الشكل ، تم التحقق من وجود قطرات دهنية معزولة من خلايا الزغابات المشيمية البشرية عن طريق تلطيخها بصبغة مضان خاصة بالدهون المحايدة بودا P 4 93 5 0 3 وتصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

كما هو موضح هنا ، تم تقييم نقاء كسور قطرات الدهون المعزولة عن طريق النشاف الغربي باستخدام بروتينات العلامة لقطرات الدهون التي تضمنت para lippin two calnexin ل er ، وعلامة goi ، و GM one 30 CO X four للميتوكوندريا وغشاء البلازما ، MEK واحد. بعد التدهور ، يتم استخراج قطرات الدهون مع الأسيتون البارد والبروتينات. تعرضت الكسور لشقاف غربي para lipin.

ثانيا ، تم اكتشاف بروتين قطرات الدهون في المادة الطافية بعد النووية وفي الطبقة البيضاء العائمة المعزولة التي تحتوي على قطرات دهونية. لم يتم اكتشاف البروتينات الخاصة بأغشية البلازما مثل MK one و GM one 30 في كسور قطرات الدهون في أي من الطبقتين أسفل الطبقة العائمة للدوران الرابع والدوران الخامس. كما ورد سابقا ، تم اكتشاف بروتين كالنيكسين وتلوين ضعيف لبروتين غشاء الميتوكوندريا CO X four في مكان آخر في جزء قطرات الدهون.

تتوافق هذه النتائج مع التقارير السابقة التي تظهر أن قطرات الدهون تتفاعل مع الميتوكوندريا في خلايا الثدييات ومع ER r. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الطرق البروتينية والدهون لدراسة أسئلة إضافية مثل العوامل المرتبطة بالقطرات.