والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

يتيح هذا البروتوكول التحليل السريع للمكونات الرئيسية لـ lipid drop في الخميرة. يبدأ الإجراء بحصاد خلايا الخميرة وغسلها، ثم توضع الخلايا المغسولة في مزيج من الكلوروفورم والميثانول بنسبة واحد إلى اثنين، وتُحلل باستخدام الخرز الزجاجي.

تؤدي إضافة الكلوروفورم والماء إلى فصل الطورين. يتم جمع الطور العضوي وتجفيفه، ثم تذاب الطبقة الدهنية في الكلوروفورم لتخزينها قبل إجراء تحليل طيف الكتلة. تُخفف الدهون المستخلصة في الكلوروفورم والميثانول مع هيدروكسيد الأمونيوم، ثم يُضاف مزيج من المعايير الداخلية.

يمكن الآن حقن محلول الدهون مباشرة في مطياف الكتلة. مرحباً، أنا سايمون بورك من مختبر فلاديمير تيكو في قسم الأحياء بجامعة كونكورديا. سأعرض لكم اليوم طريقة لتقدير كمية دهون الخميرة باستخدام مطياف الكتلة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تغيرات الدهون في الخميرة تحت ظروف نمو مختلفة. لذا، لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، أعد تعليق كرات الخميرة المجمدة التي تم تحضيرها مسبقاً في 1.6 milliliters من الماء المقطر المبرد في الثلج، وانقل 1.6 milliliters من معلق الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي زجاجية عالية السرعة.

لاحظ أنه خلال هذا الإجراء، تُجرى جميع عمليات المناولة للدهون المستخلصة باستخدام ماصات زجاجية أو محاقن. ونظراً لأن المواد البلاستيكية ستؤدي إلى إشارة خلفية كبيرة إذا لامست الكلوروفورم، ابدأ استخلاص الدهون بإضافة ستة ملليلتر من خليط الكلوروفورم والميثانول بنسبة واحد إلى اثنين و0.8 ملليلتر من الحبيبات الزجاجية المقاسة في أنبوب إينور إلى معلق الخلايا. إن الأحجام الدقيقة ليست حاسمة طالما تم الحفاظ على نسبة واحد إلى اثنين إلى 0.8 للكلوروفورم والميثانول والخميرة المعلقة في الماء. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس.

يتم خلط معلق الخلايا مع الخرز الزجاجي مرتين لمدة دقيقة واحدة في كل مرة، ثم يُضاف 2 mL من الكلوروفورم مع الخلط بلطف، ثم تُحضن العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الخلط من حين لآخر. بعد انتهاء فترة التحضين التي استمرت خمس دقائق، يُضاف 2 mL من الماء المقطر ويُخلط المزيج بلطف. بعد ذلك، تُحضن العينة مرة أخرى لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الخلط من حين لآخر.

وهنا أيضاً، من الأكثر أهمية الحفاظ على نسبة 2 إلى 2 إلى 1.8 لكل من الكلوروفورم والميثانول والماء بدلاً من الالتزام بحجم محدد. عند اكتمال فترة التحضين الثانية، يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بسرعة 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، ثم تُجمع كل السوائل الطافية من عملية الاستخلاص الأولى هذه في أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد عالي السرعة، ويُضاف 3.2 milliliters من الكلوروفورم إلى رواسب الخلايا المتبقية لإجراء عملية استخلاص ثانية للدهون.

قم برجّ كتل الخلايا مع الكلوروفورم المضاف باستخدام جهاز الـ Vortex مرتين، لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs. وفي درجة حرارة الغرفة، أضف الراشح الناتج عن عملية الاستخلاص الثانية هذه إلى الراشح الذي تم جمعه بعد عملية الاستخلاص الأولى. بعد ذلك، قم بطرد الراشحات المجموعة مركزياً لمدة خمس دقائق.

عند 3000 Gs وفي درجة حرارة الغرفة، تذوب الدهون المستخلصة الآن في الطور العضوي السفلي. تخلص من الطور المائي العلوي وانقل الطور السفلي إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد عالي السرعة. وللحصول على أطياف أكثر نقاءً في جهاز مطياف الكتلة، قم بطرد الطور العضوي مركزياً لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، ثم انقل كامل الراشح إلى قارورة زجاجية.

جفف الدهون المذابة تحت تيار من النيتروجين، ثم أذب غشاء الدهون المجفف في 500 µL من الكلوروفورم واحفظه في درجة حرارة -20 °C حتى يحين وقت تحليل العينات باستخدام مطياف الكتلة. ابدأ بتحضير خليط قياسي من الدهون في الكلوروفورم كما هو موضح في الجدول 1 الموجود في البروتوكول المكتوب المرفق. يمثل كل نوع من الدهون فئة مختلفة.

يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة 20- درجة مئوية لاستخدامه لاحقاً قبل حقن الدهون المستخلصة في مطياف الكتلة. اخلط 10 µL من العينة مع 10 µL من المزيج القياسي للدهون. يرجى ملاحظة أنه يمكن تغيير نسبة المعيار إلى العينة حسب الحاجة.

قم بفصل خليط الدهون الخاصة بالعينة والمعيار باستخدام مطياف الكتلة Q to F ذو كتلة ميكروية، مجهز بمصدر رش كهربائي نانوي يعمل بمعدل تدفق 1 µL/min. التفاصيل الخاصة بالإعدادات موضحة في الجدول 2 من البروتوكول المكتوب المرفق. وعلى الرغم من أن استخدام الدقة العالية لمطياف الكتلة Q to F يعد ميزة إضافية، إلا أنه ليس شرطاً إلزامياً.

تختلف معلمات الجهاز الدقيقة بين أجهزة مطياف الكتلة. بعد الحصول على البيانات، يتم تنعيم أطياف الكتلة، وطرح الخلفية، وتوسيط القمم. وأخيراً، يتم تصدير قائمة القمم إلى برنامج excel.

بعد ذلك، قم بتطبيع قمم كل زجاجة دهون (lipid glass) بناءً على المعيار الداخلي الخاص بها. وبناءً على التطبيق المستخدم، قد يكون من الضروري إجراء عمليات معالجة لاحقة إضافية مثل إزالة النظائر (de-isotope) وفك الالتفاف (deconvolution). تتيح هذه الطريقة التحديد السريع والمتعمق للمكونات الرئيسية لـ lipid do في الخميرة.

لقد قمنا هنا بتسليط الضوء على أحد الدهون، والذي تم فك التلافيف النظائرية له ومعايرته وفقاً لمعياره الداخلي. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية عزل دهون الخميرة وكيفية تحديد دهون الخميرة باستخدام مطيافية الكتلة بالتأين بالترذيذ الإلكتروني. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر تجنب استخدام المواد البلاستيكية والحفاظ على عينتكم ضمن النطاق الخطي للتركيزات.

تتسم هذه الطريقة بمرونة كبيرة، ويمكن تغيير العديد من الأحجام فيها حسب الحاجة. كما أن بروتوكول الاستخلاص هذا مناسب لطرق أخرى لتحليل الدهون، مثل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ومطياف الكتلة متعدد الأبعاد. وبهذا نكون قد انتهينا.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.