جيل من القص التصاق خريطة طريق SynVivo شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على خريطة التصاق مطلقة لالتصاق جسيمات الخلية من تجربة واحدة باستخدام شبكات الأوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء جهاز الموائع الدقيقة أولا بالبروتين محل الاهتمام في هذه الحالة أفادون. كخطوة ثانية ، يتم حقن جزيئات البيوتينيل في الجهاز بمعدلات قص فسيولوجية ، والتي ترتبط بالجهاز المطلي ب avadon بأنماط تفاضلية اعتمادا على معدلات القص المحلية.

بعد ذلك ، يتم حساب عدد الجسيمات المرتبطة من أجل إنشاء خريطة التصاق مطلقة للجسيمات باستخدام قاعدة بيانات تم إنشاؤها حسابيا لقيم المعدل المطلق في الشبكة. تظهر النتائج أنه يمكن الحصول على خريطة التصاق مطلقة من تجربة واحدة مما يؤدي إلى توفير كبير في الوقت والكواشف مقارنة بغرف تدفق الألواح المتوازية التقليدية. الميزة الأساسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل قنوات التدفق الخطي ، هي أنه يمكننا إنشاء خرائط مشتركة من تجربة واحدة مما يؤدي إلى توفير كبير في التكلفة والوقت.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توصيل الدواء ، مثل قدرة مركبات توصيل المخدرات على الارتباط بالأهداف المرغوبة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نستخدم غرف تدفق لوحة مجداف لفهم آفة معينة للخلية. في ظل ظروف السوائل ، على الرغم من ذلك ، ينصب تركيز هذا الاختبار على توفير رؤى أساسية حول التصاق الجسيمات والخلية.

يمكن تطبيق منصة syn vivo على مجموعة متنوعة من الأنظمة الأخرى مثل توصيل السرطان والجهاز العصبي المركزي والعدوى والالتهابات والخلل الوظيفي في دوران الأوعية الدقيقة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات جهاز السوائل الدقيقة ، والتعود على أحجام العينات الصغيرة ، ويتم توصيل أفضل الممارسات لتجنب تكوين الفقاعات بشكل أفضل بصريا. ستظهر الإجراء آشلي سميث ، عالمة أبحاث من مختبرنا.

يتكون جهاز الموائع الدقيقة SynVivo SMN من مجموعتين من المنافذ المتوازية ، واحدة للتدفق في طلاء السطح ، والشقوق و / أو الخلايا للجلوس ، والأخرى لتشغيل الفحص. للبدء ، اغمر الجهاز بالكامل في طبق بتري يحتوي على ماء معقم منزوع الأيونات وضع الطبق في فراغ. يسمح المجفف بتشغيل المجفف حتى تتم إزالة كل الهواء من قنوات الجهاز.

يجب أن يستغرق ذلك حوالي 15 دقيقة قبل إخراج الجهاز من الماء. استخدم ملقطا دقيقا لوضع أنبوب تيجون مجهزا بالماء في كل منفذ من منافذ الجهاز. يجب أن يكون طول الأنبوب حوالي بوصة واحدة.

يمكن الآن إزالة الجهاز من الماء باستخدام ماصة أو حقنة. ضع قطرة ماء حول قاعدة أنبوب منفذ مدخل واحد. قم بإزالة الأنبوب بعناية.

ستمنع قطرة الماء دخول الهواء إلى الجهاز. بعد ذلك ، قم بإعداد حقنة سعة مليلتر واحد محملة بأفادون بتركيز 20 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتوصيل المحقنة بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 24 وأنبوب المشبك ، ولا يتم استخدام منفذ المدخل مع مشبك الفك.

أدخل الأنبوب في منفذ مدخل الجهاز. حقن أفادون بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة لمدة 10 دقائق للسماح بالتروية الكاملة للجهاز. في نهاية وقت التدفق.

قم بتثبيت كل الأنابيب بمشابك الفك وضع الجهاز على أربع درجات طوال الليل. اسمح للجهاز بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الجهاز على مجهر مضان مقلوب مزود بمرحلة آلية وكاميرا عالية الأداء.

تحضير محلول من جزيئين من ميكرون بيوتينيل بتركيز 5 ملايين جسيم لكل مليلتر في محلول ملحي عازل للفوسفات أو PBS. قم بتحميل الجزيئات في حقنة سعة مليلتر واحد. قم بإعداد حقنة ثانية سعة مليلتر واحد من PBS.

قم فقط بتحميل كل حقنة على مضخة حقنة، ثم قم بتوصيلها بالإبرة والأنابيب باستخدام حقنة ماصة. ضع قطرة ماء حول قاعدة أنبوب منفذ المدخل وقم بإزالة الأنبوب المستخدم لطلاء الجهاز بعناية. أدخل الأنبوب بعناية للجزيئات الحيوية والبرامج المتعددة البرامج في كل منفذ من منافذ المدخل.

ثم ابدأ في حقن جزيئات البيوتينيل بمعدل تدفق 2.5 ميكرولتر في الدقيقة. راقب منفذ المدخل على المجهر عند أول علامة على الجسيمات. ابدأ المؤقت واستمر في التدفق لمدة ثلاث دقائق.

في نهاية الدقائق الثلاث ، أوقف تدفق الجسيمات الحيوية مع بدء تدفق PBS بمعدل تدفق 2.5 ميكرولتر في الدقيقة في نفس الوقت. اسمح ل PBS بالتدفق في الجهاز لمدة ثلاث دقائق لغسل الجسيمات غير المرتبطة. لبدء الاستحواذ ، استخدم وظيفة مسح الصورة الكبيرة في برنامج التصوير للحصول على صورة الجهاز بأكمله ، ثم بالتتابع ، قم بترقيم التشعبات في الجهاز وإنشاء منطقة اهتمام دائرية بقطر ضعف القنوات.

في هذه الحالة ، اضبط قطر منطقة الاهتمام على 200 ميكرون لأن قطر القناة هو 100 ميكرون. استخدم وظيفة الجرد التلقائي في برنامج التصوير لتصدير عدد الجسيمات في كل مجال من مجالات الاهتمام إلى جدول بيانات. وبالمثل ، استخدم ميزة الحساب الآلي لتصدير عدد الجسيمات في الجهاز بأكمله.

يتم تشغيل محاكاة CFD ويتم تخزين النتائج في قاعدة بيانات لمزيد من التحليل. تحتوي المعلومات المضمنة في النتائج على معدلات قص الجدار وتدفق جسيمات السرعة والالتزام بالجهاز. تستخدم المعلومات هنا لتحديد عدد الجسيمات التي تلتصق في كل منطقة من مجالات الاهتمام بالنظر إلى مدخلات محددة لتركيز الجسيمات.

لإنشاء خريطة التصاق القص، احسب النسبة المئوية للالتصاق كما هو مفصل في بروتوكول النص كخطوة أخيرة. ارسم خريطة الالتصاق المطلقة باستخدام المعدل الهائل عند كل تشعب للشبكات وقيم الالتصاق المئوية. تظهر هذه الصورة جهاز SMN نموذجي مطلي ب avidan بعد ربط جزيئين من ميكرون بيوتينيل.

لاحظ أن الجسيمات تلتصق بشكل تفضيلي بالقرب من التشعبات في الشبكة. يمكن رؤية التشعبات المرقمة في شبكة syn vivo SMN هنا. هذه الصورة هي عينة خريطة قص الجدار التي تم إنشاؤها بواسطة نموذج CFD للجهاز.

يختلف معدل القص في الجهاز الذي يتراوح من 250 ثانية عكسية إلى 15 ثانية عكسية كما لوحظ في الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي. لاحظ أنه لا يمكن الحصول على معدلات القص المتغيرة هذه في وقت واحد في قنوات الموائع الدقيقة الخطية لأنها توفر معدل قص ثابتا لكل معدل تدفق. يكشف المخطط المبين هنا لقيم معدل القص عند كل من تشعبات الشبكة أن أنماط معدل القص معقدة ولا يمكن الحصول عليها بعلاقة تحليلية بسيطة على عكس قنوات التدفق الخطي.

علاوة على ذلك ، توجد تشعبات متعددة في الشبكة تقع في نفس الحاوية الشفافة. إضافة إلى الثقة الإحصائية للبيانات المعروضة. فيما يلي عينة من نتائج تحليل CFD لتدفقات الجسيمات في الشبكة ، والتي تستخدم لحساب تدفقات الجسيمات في فروع وتشعبات الشبكة التجريبية.

خريطة الالتصاق المطلقة المحسوبة من تجربة متزامنة واحدة في الجسم الحي SMN العلاقة العكسية كما لوحظ من خرائط الالتصاق المطلقة التي تم الحصول عليها من تجارب القنوات الخطية. ومع ذلك ، باستخدام اختبار SynVivo ، تسمح تجربة واحدة بإنشاء هذه الخريطة المطلقة ، بينما يتم الحصول على العديد من عمليات التشغيل التجريبية من القنوات الخطية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام أجهزة SynVivo SMN لإنشاء الالتصاق المشترك من تجربة واحدة.

عند إجراء هذه التجربة ، من المهم أن تتذكر عدم إدخال الفقاعات إلى جهاز الموائع الدقيقة SynVivo SMN بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الالتهاب لدراسة تفاعل بطانة الكريات البيض بمعدلات مختلفة في تجربة واحدة. في الجيل التالي من الأجهزة ، يمكن للباحثين دراسة التصاق الكريات البيض المتدحرجة والهجرة في اختبار واحد ، وهو أمر غير ممكن حاليا.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى للتحقيق في التصاق الأدوية ومركبات توصيل الأدوية والخلايا للتحقيق في أسئلة مثل التأثير الفسيولوجي للتدفق على خلية الخلية ودواء الخلية والتصاق مركبة المخدرات.