تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التعديلات اللاحقة للترجمة للبروتينات المشاركة في مجمعات البروتين النباتي التي يتم التعبير عنها أولا بشكل عابر أو ثابت في بلانا العلامات البروتين ذي الأهمية. ثم استخرج البروتينات الكلية من أنسجة النبات ، وقم بترسيب البروتين محل الاهتمام. بعد ذلك ، افصل البروتينات المترسبة المناعية على هلام الأكريلاميد واستخرج البروتينات وهضمها من شريط الهلام المعني.

الآن أرسل عينات البروتين لقياس الطيف الكتلي. في النهاية ، يمكن لنتائج قياس الطيف الكتلي اكتشاف التغيرات الديناميكية في تعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفرة. على عكس الطرق البديلة مثل حضانة كيناز في المختبر مع الركيزة ، تعبر هذه الطريقة عن البروتينات في الغراس.

لذلك ليس عليك معرفة الكيناز المسؤول عن الفسفرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النبات ، مثل كيفية نقل الإشارات استجابة للإجهاد أو التغيرات البيئية أو التعرف على مسببات الأمراض. بالإضافة إلى تحديد الفسفرة ، مواقع مجمعات البروتين المقاومة المنشطة ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على أي تعديل ما بعد الترجمة لأي مركب بروتين نباتي.

عموما, الأفراد الجدد على هذه الطريقة سوف تكافح لأنهم لم يتم اعتيادهم على العمل مع كمية كبيرة من استخراج وتنفيذ المزيد من خطوات البروتوكول في يوم واحد. للتعبير العابر ، قم بزراعة سلالات agrobacterium tohin إلى المرحلة الثابتة. حصاد البكتيريا الزراعية عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جم لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الكريات ومخزن التسلل. مخزن مؤقت. الآن يتسلل. نباتات NCOA hamana التي يبلغ عمرها أربعة أسابيع مع البكتيريا الزراعية يدويا باستخدام حقنة بدون إبرة سعة واحدة مليلتر أو عن طريق الفراغ باستخدام 0.02٪ خافض للتوتر السطحي ، بعد يومين إلى خمسة أيام من التسلل.

احصد الأوراق والأوراق المتسللة وقم بتجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك يطحن 20 جراما من الأنسجة النباتية والنيتروجين السائل باستخدام ملاط ومدقة عند 80 مل من المخزن المؤقت البارد C إلى 20 جراما. تخلط جيدا وتذوب على الثلج.

الآن تجانس بثلاث رشقات نارية مدة كل منها 10 ثوان بأقصى سرعة. قم بتصفية المتجانس وجهاز الطرد المركزي عند 30،000 Gs لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، إلى 100 ميكرولتر من مصفوفة التقارب المناسبة عند 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب البارد D لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وغسلها ثلاث مرات بمليلتر واحد من المخزن المؤقت البارد D. بعد ذلك ، قم بإزالة مستخلص الورقة وقم بتمريره عبر حقنة 0.45 ميكرومتر.

قم بالتصفية في أنبوب جديد على الجليد. Aliquot من المستخلص الخام. لبقعة مناعية.

أضف خمس دوامة عازلة لتحميل صفحات XSDS وقم بغلي العينات لتشويهها. أضف 50 ميكرولترا من مصفوفة التقارب ، معلقة في المخزن المؤقت D لكل أنبوب. احتضان مع دوران لطيف لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي للكريات مصفوفة التقارب.

ثم خذ حصة من المستخلص غير المرتبط للحصول على بقعة مناعية. تخلص من باقي العقل ، واترك ما يقرب من 500 ميكرولتر في قاع الأنبوب. أعد تعليق محلول الملاط بطرف تجويف عريض.

قم بتجميع محلول الملاط المختلط من كلا الأنبوبين في أنبوب واحد سعة 1.5 مل. نبض ثلاث مرات لمدة خمس ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة لترسيب مصفوفة التقارب وإزالة supernat بعد ثلاث إلى خمس غسلات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت البارد D. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد D باستخدام إبرة حقنة مع 200 ميكرولتر من مخزن الشطف المناسب تحت الاهتزاز المستمر. اسحب EITs الثلاثة في أنبوب واحد.

ثم ركز البروتينات باستخدام 30 ميكرولتر من دوامة راتنج الامتصاص. دعونا نقف لمدة خمس دقائق ونترسب الراتنج ، ونتخلص من supernat. أضف 50 ميكرولترا من مخزن مؤقت لتحميل صفحة XSDS إلى مصفوفة التقارب المترسبة أو دوامة راتنج الامتصاص واتركها تغلي لمدة 10 دقائق عند 80 إلى 100 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي للكتلة الحرارية.

مصفوفة التقارب المسلوقة عبارة عن راتنج لمدة دقيقتين عند 10 ، 000. GS aliquot خمسة ميكرولترات من supernat للكتلة المناعية وتشغيلها مع كسور أخرى على صفحة SDS بطول 10 سم. جل لفصل وتحديد البروتينات الفسفرة عن طريق قياس الطيف الكتلي.

قم بتحميل 45 ميكرولترا المتبقية على بقعة جل صفحة SDS. جل صفحة SDS مع تألق كاماسي الغروي الأزرق. ثم احتجز الجل بغسيلها والماء الغزير ، ويفضل أن يكون ذلك طوال الليل.

الآن باستخدام مشرط نظيف ، قم باستئصال نطاق الاهتمام من الجل ، وقم بتقطيع شريحة الجل إلى مكعبات من ملليمترات إلى أربعة ملليمترات وانقل العينة إلى أنبوب. اغسل قطع الجل مع 50٪ أسيتو نتريل و 50 مللي مولار بيكربونات الأمونيوم حتى تحل البقع. ثم ماصة من المحلول.

مع الحرص على عدم إزالة قطع الجل. جفف العينة مع 100٪ أسيتو النتريل لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة السائل الحر. ثم لتقليل روابط البروتين دي كبريتيد عند 10 مللي مولار DTT واحتضانها لمدة 30 إلى 45 دقيقة عند 56 درجة مئوية مع الاهتزاز ، قم بإزالة السائل الحر الآن إلى بقايا السيستين المؤلكلات.

أضف 55 ملليمولار كلورو أسيتاميد لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بإزالة السائل الحر ، ثم اغسلي قطع الجل مرتين باستخدام 50٪ أسيتو نتريل لمدة 10 دقائق. إزالة السائل الحر.

الآن قم بتجفيف قطع الجل باستخدام 100٪ أسيتو نتريل لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة السائل الحر من أجل Triptych Digest. عند 40 ميكرولتر من محلول عمل التربسين ، اترك قطع الجل ترطيب لمدة 10 دقائق في مخزن هضم كاف لتغطية قطع الجل. احتضان عند 37 درجة مئوية طوال الليل لوقف الهضم واستخراج الببتيدات من قطع الجل عند 5٪ سونيكات حمض الفورميك لمدة خمس إلى 10 دقائق.

ثم انقل السوبر إلى أنبوب جديد ، وجفف الببتيدات عن طريق التجميد أو مكثف فراغ ، وقم بتخزين العينات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. تعمل هذه التجربة على تنقية مركب P-R-F-P-T-O kinase من nacoa hamana ، تم تحويل NACOA hamana المعدلة وراثيا التي تعبر عن 35 SPTO بشكل عابر مع 35 علم SPRF ، وتم ترسيب المركب مناعيا باستخدام Anti-Flag M two aros. توضح البقع المناعية الترسيب المناعي الفعال لبروتين PRF المستهدف ، كل من PTO وبروتين المستجيب المتفاعل المنقى مع PRF كما هو موضح في اكتشاف الأجسام المضادة وتحليل قياس الطيف الكتلي.

هنا ، كانت الإستراتيجية هي استهداف بروتين PTO باستخدام Anti-Flag. تم تغيير الاستراتيجية. من أجل تحديد مواقع فسفرة PTO.

تم ترسيب الكمية الإجمالية لبروتين PTO الذي يتكون من كل من مركب PRF والشكل الحر بالمناعة باستخدام Anti-Flag M two aros وتخضعت لتجزئة صفحة SDS ، وهضم ثلاثي البقع ، وتحليل طيفي الكتلة أدى إلى ببتيدات PTO تمتد على ما يقرب من 80٪ من تسلسلها. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تحديد مجموعة من مواقع الفسفرة المفردة لببتيدات PTO. لاحظ أنه تم تحديد مواقع الفسفرة المزدوجة فقط في وجود أي من البروتين المستجيب.

من المهم الحصول على كميات كافية من البروتين النباتي من أجل تحديد مكونات مركب البروتين وكذلك اكتشاف التعديل اللاحق للترجمة للبروتين ذي الأهمية. تذكر أن تعديلات رسم الخرائط مثل الفسفرة تتطلب كمية معقولة من البروتين من قياس الطيف الكتلي ، لذلك يجب أن يكون هناك شريط باهت على الأقل واضح على الجل الخاص بك باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل I ، تحديد المكونات المعقدة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف يؤدي تنشيط المركب المناعي إلى مناعة وظيفية.

لا تنس أن العمل مع المخازن العضوية والبكتيريا ومكبرات الحلاقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا اتخذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف اللفة.