انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البلاست، على سبيل المثال، تكوين آلات استيراد البروتينات بالبلاست. وهو ضروري للخضرة والتنميثيل الضوئي وبالتالي لإنتاج الغذاء على هذا الكوكب. الجهاز الجزيئي يتكون من اثنين من مجمعات منفصلة في العضو الخارجي والداخلي من chloroplast دعا TOC وTIC، ولكن تكوين غير معروف تماما.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن تنقية مجمع آربيدبسيس TOC / TIC يمكن أن يتحقق في طريقة تنقية خطوة واحدة، TAP-TOC تنقية. بل هو أسلوب محدد وفعال. عموما، قد يعاني الباحثون الجدد على هذه الطريقة لأنهم ليسوا على دراية بعزل كسور غشاء البلاست أو المنظفات أو solubilization أو تنقية التقارب.

بعد إعداد النباتات العربية، طحن 10 غرام من الشتلات من العمر ثلاثة أسابيع في النيتروجين السائل، وذلك باستخدام قذائف الهاون الباردة والأوبئة مع الرمال. إضافة 20 ملليلتر من عازلة طحن الباردة إلى الأنسجة الأرض. تخلط جيدا ونترك الخليط يذوب على الجليد.

بعد ذلك، نقع طبقتين من المواد الترشيح السريع مع طحن العازلة. تصفية المتجانسة من خلال طبقتين من مواد الترشيح في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي الترشيح في 1، 500 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ونقل فائقة إلى الطازجة، قبل المبردة أنبوب الطرد المركزي المخروطية 50 ملليلتر.

كرر الطرد المركزي مرة أخرى في نفس الظروف. نقل supernatant إلى أنبوب 38.50 ملليلتر فائقة الوضوح الباردة وأعلى تصل إلى 35 ملليلتر مع عازلة طحن الباردة. استخدام الطرد الفائقة إلى الطرد المركزي العينة في 100، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

باستخدام التجانس تفلون الزجاج، resuspend بيليه الخضراء في طحن العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة والتخلص من الفائق. استخدام الزجاج تفلون التجانس لإعادة تعليق بيليه الخضراء في 18.75 ملليلتر من واحد × طحن العازلة.

ثم إضافة آخر 9.375 ملليلتر من واحد × طحن العازلة. إضافة 9.375 ملليلتر من أربعة حل solubilization x لجعل الحجم النهائي إلى 37.5 ملليلتر واحتضان على شاكر الدورية في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، استخدم الطرد الفائق التركيز على الطرد المركزي العينة في 100، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

نقل فائقة تحتوي على الأغشية solubilized إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر جهاز طرد مركزي مخروطي. بعد إعداد راتنج أجاروز IGG، نقل راتنج IGG agarose المغسولة سابقا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على 37.5 ملليلتر من الأغشية المُسَنَّقة. احتضان على مدى الليل على شاكر الدورية في أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي، رواسب راتنج أجاروز IGG في 100 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. استخدام ماصة لإزالة افرا. كان راتنج IGG agarose في 37.5 ملليلتر من العازلة A واحتضان على شاكر الدورية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

مواصلة الترسيب وغسل الراتنج كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل راتنج أجاجوز إلى عمود تدور 500 ميكرولتر مع مرشح 35 ميكرون. غسل الخرز مرتين مع 300 ميكروليترس من عازلة elution TEV لتكييف.

المقبل، إضافة 300 ميكرولتررس من TEV elution العازلة تحتوي على 10 ميكرولترات من بروتياز TEV. احتضان العمود تدور مع الخرز في Thermomixer في 16 درجة مئوية و 350 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. ثم، افتح عمود الدوران وضعه في أنبوب جديد ونظيف و1.5 ملليلتر.

تدور هذه الأنبوبة في 100 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لجمع eluate. في هذه الدراسة يتم تنقية TAP معلمة كلوريد مغلف بروتين مجمع من النباتات A.thaliana المعدلة وراثيا. يؤكد تحليل مناعي أن عزل TAP-TOC159 يتفاعل مع TOC75 و TOC33 من مجمع TOC.

كما أن كيناز الغشاء الخارجي للبلاست، KOC1، المعروف بفوسفوريل TOC159، هو أيضاً معزول. يكشف وجود TIC110 أن مجمع TAP-TOC159 المعزول يحتوي أيضًا على مكونات مجمع TIC. ولم يتعرف الجسم المضاد FBN1A على مركب TAP-TOC159، مما يشير إلى عدم وجود تلوثات.

في السيطرة السلبية، لم البروتين NTAP المناعية لا تشارك في عزل مع أي من TOC، بروتينات TIC ويؤكد خصوصية تنقية TAP-TOC159. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستيراد البروتينات chloroplast، فإنه يمكن أن يحتمل أن تطبق على أي مجمع آخر في نظام زجاجة ثاليانا Arabidopsis. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق أساليب أخرى مثل نقّاف غربي أو قياس الطيف الكتلي إما لإثبات وجود مكونات معروفة أو لتحديد مكونات جديدة لمجمعات TOC و TIC.

مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال استيراد البروتينات من البلاستيك من أجل استكشاف وظيفة المكونات الجديدة لمجمعات الـ TOC وTIC.