الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي
مارس 28, 2014
تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن تفاعلات الجسيمات النانوية الفلورية مع مجموعات الخلايا المناعية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا ذات الأهمية أولا بالجسيمات النانوية. في الخطوة التالية ، يتم تصنيف الخلايا بجسم مضاد ضد علامات السطح الخاصة بالخلية ثم يتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
في النهاية ، يمكن قياس تفاعل الجسيمات النانوية مع مجموعات الخلايا المناعية الفردية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكن قياس الاختلافات في شدة التألق التي تسببها الجسيمات النانوية في مجموعات الخلايا غير الملتصقة لاستيعاب الجسيمات النانوية في الدم البيضاء ، أو الخلايا الوحيدة المنقاة تبدأ بالطلاء خمس مرات 10 إلى خمس الخلايا ذات الأهمية في مليلتر واحد لكل بئر. في كل بئر من 12 بئر صفيحة.
ثم أضف 10 ميكرولترات من تعليق الجسيمات النانوية لثاني أكسيد السيليكون الفلوري المحضر حديثا إلى كل بئر تجريبي ، مع إضافة حجم متساو من الوسط الكامل إلى آبار التحكم غير المعالجة في هذا الوقت أيضا. بعد استيعاب ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، انقل العينات إلى أنابيب بولي بروبلين فردية سعة 1.5 مليلتر ، ثم قم بتدوير العينات لمدة ثلاث دقائق عند 6،000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لتلطيخ الخلايا بقرص مضغوط 14 عبر احتضان 100 ميكرولتر من كل معلق خلية في 10 ميكرولتر من الجسم المضاد البشري بنسبة واحد إلى 11 في تشغيل المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الجسم المضاد غير المرتبط في مليلتر واحد من المخزن المؤقت الجاري ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج لتحليل قياس التدفق الخلوي.
بعد ذلك ، لإعداد تعويض الامتداد الطيفي ، افتح مربع إعدادات الجهاز في برنامج قياس التدفق الخلوي ، ثم احصل على عينة خالية من الجسيمات النانوية غير المسماة بجسم مضاد بسرعة سائلة منخفضة. يعد ضبط إعدادات التعويض في وجود الجسيمات النانوية الفلورية هو أصعب جزء من الإجراء حيث يمكن للجسيمات النانوية أن تتداخل مع التشتت الجانبي لضمان النجاح ، ويجب تحديد بوابة لمجموعة الخلايا ذات الأهمية اضبط التشتت الأمامي والجانبي يدويا عن طريق تنظيم قنوات الجهد. ثم ارسم بوابة كبيرة بشكل مناسب حول مجموعة الخلايا المطلوبة.
قم بتحميل عينة أخرى غير مسماة، وافتح علامة تبويب التعويض في مربع إعدادات الجهاز. اضبط عامل التعويض أثناء الاستحواذ حتى تكون شدة التألق في قناة الامتداد هي نفسها تقريبا بالنسبة للمجموعات السكانية الإيجابية والسالبة للفلوروكروم. أخيرا ، بعد ضبط التعويض لكل أنبوب تحكم فلوروكروم ملطخ ، اقرأ العينات المعالجة بالجسيمات النانوية في محاولة لتوصيف سلوك خلايا الدم البيضاء بشكل أفضل استجابة للجسيمات النانوية ، تم إجراء فحوصات الاستيعاب كما هو موضح للتو.
على سبيل المثال ، في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحديد ثلاث مجموعات سكانية فرعية رئيسية من كريات الدم البيضاء بوضوح عن طريق التشتت الأمامي والجانبي بعد عزل PBMC. علاوة على ذلك ، بعد معالجة ثاني أكسيد السيليكون fz ، أظهرت الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا المحببة معدلات استيعاب مختلفة للجسيمات النانوية كما يتضح من شدة تألقها. في هذه الصور ، يتم توضيح استيعاب الجسيمات النانوية في الخلايا الوحيدة الموجبة CD 14 الأولية المنقاة من pbmc.
تعرض هذه المخططات المبعثرة الخلايا الوحيدة الموجبة CD 14 في وجود جزيئات ثاني أكسيد السيليكون النانوية في فيتز. يوضح الرسم البياني القياس الكمي للخلايا الموجبة اللطيفة التي يتم التعبير عنها على أنها شدة التألق. تم إجراء تجارب استيعاب مماثلة مع الخلايا الوحيدة TP one المعالجة بتركيزات متزايدة من جزيئات ثاني أكسيد السيليكون النانوية في فيتز مع خلايا غير معالجة كعنصر تحكم سلبي.
توضح المخططات النقطية الزيادة المعتمدة على الجرعة في التشتت الجانبي مع تشتت أمامي غير متغير في خط خلية TP واحد بعد استيعاب الجسيمات النانوية. تشير البيانات من هذه الرسوم البيانية إلى أن العلاج بجسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية من فيتز يحفز استيعاب يعتمد على الجرعة في الخلايا الوحيدة التي تم تسليط الضوء عليها من خلال تعزيز الحبيبات داخل الخلايا لاكتساب مزيد من التبصر في التفاعلات بين الخلايا المناعية والجسيمات النانوية ، تم زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة لمدة سبعة أيام في المختبر واحتضانها بالجسيمات النانوية لمدة ساعة واحدة. أشار الفحص المجهري الفلوري إلى ثقافة الخلايا الدبقية الأولية المختلطة مع عدد كبير من الخلايا النجمية غير الملتصقة السلبية GFP وبعض الخلايا الإيجابية GFP.
في هذه التجربة التمثيلية ، يمكن تمييز ثلاثة مجموعات سكانية فرعية دبقية عن طريق قياس التدفق الخلوي مع جسم مضاد واحد CD 11 B تلطيخ CD 11 B ، والخلايا النجمية السلبية GFP السلبية والخلايا الدبقية الأخرى الخلايا الدبقية CD 11 B إيجابية GFP السلبية ، و CD 11 B إيجابية GFP الفرعية الإيجابية. المجموعتان الفرعيتان الأخيرتان قادران على استيعاب الجسيمات النانوية مع نقص متزايد قليلا من قبل السكان الإيجابيين الإجماليين. يمكن التحقق من استيعاب الجسيمات النانوية بشكل أكبر عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر كما هو موضح في هذه الصورة باستخدام الجسيمات النانوية لثاني أكسيد السيليكون الدومين.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالعينات في الظلام لتجنب تبيض الأصباغ الفلورية والحفاظ على العينات عند أربع درجات أثناء حضانة الأجسام المضادة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر للإجابة على سؤال إضافي حول توطين الجسيمات النانوية داخل الخلايا.
نظرة عامة
تركز هذه الدراسة على التفاعل بين الجسيمات النانوية الفلورية والمجموعات الفرعية للخلايا المناعية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بتقدير كمية الجسيمات النانوية التي تم استيعابها داخل مختلف الخلايا المناعية، مما يوفر رؤى حول سلوكها.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- تقنية النانو
- قياس التدفق الخلوي
خلفية علمية
- يمكن استخدام الجسيمات النانوية لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية.
- يوفر قياس التدفق الخلوي مزايا تفوق المجهر في تقدير كمية الفلورة.
- يمكن أن يساهم فهم استيعاب الجسيمات النانوية داخل الخلايا في توجيه الاستراتيجيات العلاجية.
- قد تظهر أنواع الخلايا المناعية المختلفة استجابات متفاوتة تجاه الجسيمات النانوية.
الغرض من الدراسة
- لتحليل تفاعل الجسيمات النانوية مع المجموعات الفرعية للخلايا المناعية.
- لقياس معدلات استيعاب الجسيمات النانوية داخل أنواع مختلفة من الخلايا.
- لتحسين فهم الاستجابات المناعية تجاه العلاج بالجسيمات النانوية.
الطرق المستخدمة
- تمت معالجة الخلايا المناعية الأولية بجسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية الفلورية.
- تم وسم الخلايا باستخدام أجسام مضادة محددة لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- تم ضبط إعدادات التعويض لمراعاة تداخل الجسيمات النانوية.
- أجريت مقايسات الاستيعاب الداخلي لتقييم امتصاص الجسيمات النانوية.
النتائج الرئيسية
- أظهرت مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية معدلات متفاوتة من استيعاب الجسيمات النانوية داخل الخلايا.
- مكّن قياس التدفق الخلوي من التمييز بفعالية بين أنواع الخلايا بناءً على كثافة الفلورة.
- تم تأكيد عملية الاستيعاب الداخلي من خلال تقنيات مجهرية إضافية.
- أشارت النتائج إلى وجود علاقة تعتمد على الجرعة في امتصاص الخلايا الوحيدة للجسيمات النانوية.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة فائدة قياس التدفق الخلوي في تحليل تفاعلات الجسيمات النانوية مع الخلايا المناعية.
- تساهم النتائج في فهم كيفية تأثير الجسيمات النانوية على الاستجابات المناعية.
- قد تستكشف الأبحاث المستقبلية التطبيقات العلاجية للجسيمات النانوية في علم المناعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
تتيح هذه الطريقة التقييم الكمي لاستيعاب الجسيمات النانوية داخل المجموعات الفرعية للخلايا المناعية الأولية، مما يدعم التحقق من الهدف والحد من المخاطر الميكانيكية في تطوير العلاجات النانوية. ومن خلال توفير بيانات عن الامتصاص المعتمد على الجرعة والمحدد بنوع الخلية، فإنها تعزز الثقة التنبؤية في مرحلة الاكتشاف المبكر وتوجه قرارات المتابعة أو الإيقاف للتدخلات القائمة على الجسيمات النانوية. ويعالج هذا النهج تحدياً رئيسياً في مرحلة الاكتشاف، يتمثل في تحويل التفاعلات بين الجسيمات النانوية والخلايا إلى مقاييس قابلة للتنفيذ وإعادة الإنتاج من أجل تحديد أولويات المحفظة البحثية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس كمية امتصاص الجسيمات النانوية عبر المجموعات الفرعية المناعية، مما يوضح أي المجموعات الخلوية تتفاعل مع الناقلات النانوية.
- القيمة التشغيلية: تتيح تقليل المخاطر البيولوجية من خلال قياس معياري وقابل للتكرار للعملية الداخلية عبر شدة الفلورة وتحولات تشتت الضوء الجانبي.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز المحافظ العلاجية من خلال تحديد أنواع الخلايا ذات الألفة العالية أو المنخفضة للجسيمات النانوية، مما يوجه عملية اختيار الأهداف للعلاجات النانوية المعدلة للمناعة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز أنظمة خلايا مناعية مصادق عليها لعمليات الفحص اللاحقة من خلال تحديد ملفات التفاعل المرجعية للجسيمات النانوية.
- المخرجات الكمية: توليد مقاييس لشدة الفلورة وتشتت الضوء الجانبي (SSC) تتيح قراءات موحدة وقابلة للمقارنة عبر مختلف الظروف والنقاط الزمنية.
- إعادة استخدام المنصة: دعم سير عمل عمليات الفحص القابلة للتوسع من خلال بروتوكولات متسقة لتحديد البوابات (gating)، والتعويض، ووسم الأجسام المضادة، بما يتناسب مع تركيبات الجسيمات النانوية المتنوعة.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- الأهمية المرضية: يمتد ليشمل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من الفئران المتحورة، مما يتيح دراسة الجسيمات النانوية التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي في نماذج مناعية ذات صلة بالمرض.
- الاستمرارية الترجمية: يربط نتائج قياس التدفق الخلوي بالتأكيد عبر المجهر البؤري، مما يعزز التفسير الميكانيكي للتحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يوجه قرارات التقدم من خلال الكشف عن معدلات استيعاب متباينة، مثل إظهار المجموعات الفرعية من الخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ GFP تغيرًا في امتصاص الجسيمات النانوية.
تكامل مسارات العمل والتدفقات التشغيلية
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من الفحص المبكر لارتباط الهدف وصولاً إلى التقييم الميكانيكي قبل السريري، لا سيما بالنسبة للعلاجات النانوية المعدلة للمناعة حيث تكون ملفات تفاعل الخلايا المناعية بالغة الأهمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط التعرض للجسيمات النانوية بتغيرات قابلة للقياس في حبيبية الخلايا والفلورة، مما يوضح آليات تنشيط أو تعديل الخلايا المناعية.
- الفحص: توفر الجاهزية للمقايسة من خلال خطوات عزل ووسم وتعويض معيارية تضمن تكميمًا قابلًا للتكرار للتفاعلات بين الجسيمات النانوية والخلايا.
- التحليلات: تقدم قياسات كمية للمتغيرات التابعة (شدة الفلورة، وتحولات SSC) التي تسمح بمقارنة الاستيعاب الداخلي عبر أنواع الخلايا والتركيزات والنقاط الزمنية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالتحقق قبل السريري عبر التأكيد المتعامد باستخدام المجهر البؤري، بما يتماشى مع تقليل المخاطر الآلية الموجهة نحو المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تعمل كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام عبر تنسيقات مختلفة من الجسيمات النانوية (على سبيل المثال، FITC-SiO₂ و Rhodamine-SiO₂) والنماذج المناعية (وكريات الدم البيضاء البشرية، والخلايا الدبقية الصغيرة الفأرية)، مما يقلل من تكرار تطوير الطرق.
الأثر التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال تقديم بيانات كمية بدقة الخلية حول استيعاب الجسيمات النانوية، مما يعزز الثقة في تحديد الأهداف ضمن استراتيجيات التعديل المناعي.
- القيمة التشغيلية: يضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال بروتوكولات تعويض ومجموعات أجسام مضادة محددة، مما يقلل من التباين بين المستخدمين والمواقع المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال التحديد المبكر لمجموعات الخلايا المناعية الأكثر عرضة للتفاعل مع الجسيمات النانوية، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من تطوير العلاجات النانوية.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد الأولويات بناءً على تقييم المخاطر من خلال تسليط الضوء على تركيبات الجسيمات النانوية ذات ملفات التفاعل المواتية أو غير المرغوب فيها مع الخلايا المناعية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في تعويض قياس التدفق الخلوي، خاصة لمعالجة تداخل تشتت الضوء الجانبي الناجم عن الجسيمات النانوية أثناء تصحيح التداخل الطيفي.
- تعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي ذات قدرات الكشف عن الفلورة والتشتت، بالإضافة إلى لوحات الأجسام المضادة لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا المناعية.
- تستلزم توحيد استراتيجيات تحديد البوابات (gating) وإعدادات التعويض بين الفرق لضمان اتساق تفسير البيانات بين مجموعات الاكتشاف والمجموعات قبل السريرية.
- تتطلب التكييف عند تطبيقها على أنظمة نماذج مختلفة (على سبيل المثال، الخلايا الملتصقة مقابل الخلايا غير الملتصقة، أو الخلايا الأولية البشرية مقابل الفأرية) للحفاظ على دقة المقايسة.
- قيد عملي: قد تتداخل خصائص الفلورة أو التشتت للجسيمات النانوية مع بعض الفلوروكرومات، مما يتطلب تصميماً دقيقاً للوحة وتثبتاً من التعويض كما هو موضح في البروتوكول.
