طبقة رقيقة الكروماتوجرافي (TLC) فصل واختبارات بيولوجية من المستخلصات النباتية لتحديد المركبات المضادة للميكروبات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المستقلبات النباتية المضادة للميكروبات للبكتيريا اللاهوائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق فصل مستخلص نباتي أولا عن طريق كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو TLC. بعد ذلك ، يتم تقطيع الكروماتوجرام إلى مناطق تشتمل على مركب واحد أو أكثر.

ثم يتم وضع المناطق على أجار ملقحة بالبكتيريا اللاهوائية وتحضنها. بعد الحضانة ، تتم إزالة المناطق وتلطيخ الألواح لتحديد المركبات التي تمنع نمو البكتيريا. تكشف البيانات الناتجة عن وجود أو عدم وجود مستقلبات نباتية مضادة للميكروبات.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تغذية المجترات ، مثل ما هي آثار المستقلبات الثانوية النباتية على استخدام المغذيات من قبل كائنات دقيقة معينة. على الرغم من أن هذه الطريقة تكشف عن مركبات نباتية مثبطة لبكتيريا الكرش. يمكن أيضا تطبيقه للكشف عن المركبات المثبطة للبكتيريا أو الفطريات الأخرى.

في هذا البروتوكول ، سيتم استخدام المركبات الفينولية من البرسيم الأحمر لإثبات تحديد المركبات المضادة للميكروبات عن طريق السيرة الذاتية التلامسية. ابدأ بتنظيف كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو ألواح TLC التي تعمل في غطاء الدخان. قم بإعداد مذيب تنظيف كاف لتغطية الجزء السفلي من غرفة تطوير TLC ، بالإضافة إلى الحافة السفلية للوحة A TLC.

عند وضعه داخل الغرفة هنا ، يتم تحضير ميثانول أسيتات الإيثيل اثنين إلى واحد. بعد ذلك ، ارتداء القفازات والعمل في غطاء الدخان. استخدم المقص لقطع ألواح السيليكا المرنة المدعومة بالألمنيوم أو البلاستيك لتناسب الغرفة النامية.

أدخل الألواح في الغرفة مع إمالة القمم على جدران الغرفة. يجب ألا تلمس اللوحات بعضها البعض. قم بتغطية الغرفة واترك المذيب يتحرك لأعلى الألواح عن طريق العمل الشعري.

عندما يصل المذيب إلى الجزء العلوي من الألواح ، قم بإزالتها من الغرفة ورتبها في وضع الوقوف في غطاء الدخان حتى يتبخر المذيب. بمجرد أن تجف الألواح ، تحقق لمعرفة ما إذا كانت الشوائب قد هاجرت بالقرب من الجزء العلوي من ألواح TLC. ستظهر هذه على شكل شريط أصفر تحت الضوء المرئي أو شريط فلوري تحت الأشعة فوق البنفسجية.

إذا كانت غالبية اللوحة لا تزال تحتوي على مسحة صفراء ، كرر عملية التنظيف في نفس غرفة TLC باستخدام نفس المذيب. بعد إزالة ألواح TLC من الغرفة ، تخلص من المذيب. اترك المذيب المتبقي يتبخر تماما قبل استخدام الغرفة للجزء التالي من البروتوكول.

بجانب إزالة الرطوبة المتبقية التي يمكن أن تؤثر على هجرة المركبات على السيليكا ، قم بدعم الألواح في وضع مستقيم في فرن تجفيف عند 100 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة للوحة 20 × 20 سم ، وخمس دقائق لألواح سبعة × 10 سم. بمجرد أن تجف الألواح ، اتركها تبرد إلى درجة الحرارة المحيطة قبل تحميلها بالمستخلصات. لتحضير الغرف لفصل الاستخراج ، استخدم المقص لقص قطعة من ورق الترشيح أقل بقليل من ارتفاع الغرفة وحوالي نصف محيط الغرفة في العرض.

ستعمل هذه الورقة كفتيل لسحب المذيبات لأعلى جدار الغرفة وتشبع الغرفة بأوراق المذيبات ، وبالتالي تحسين استنساخ الفواصل في غطاء الدخان ، امزج المذيبات هنا. المذيبات المستخدمة هي ميثانول أسيتات الإيثيل من أربعة إلى حجم واحد لكل حجم. يسكب مزيج المذيبات في الغرفة ويغطى.

استخدم قلم رصاص لتمييز الأصل برفق عند نقطة على لوحة TLC ستكون فوق سطح المذيب النامي في الغرفة. إذا كانت ماصة لوحة TLC ناعمة وسهلة التلف ، فقم بوضع علامات على الحواف كما هو موضح هنا. بعد ذلك ، قم بإذابة المستخلصات في مذيب عضوي كاف للحصول على محلول مركز بدلا من المعلق العكر.

هنا المذيب المستخدم هو الميثانول. يؤدي استخدام الماصات الصغيرة الشعرية أو حقنة ميكرولتر إلى تحميل المعايير والعينات كأشرطة ضيقة مع ترك حد سنتيمتر واحد على جانبي اللوحة ، والسماح للأشرطة بالجفاف ، مما يساعد تهوية اللوحة أو تحميلها في غطاء الدخان على تجفيف الأربطة بسرعة أكبر. بمجرد أن تجف العصابات ، قم بتحميل العينات مرة أخرى في نفس المكان أو فوق المكان.

إذا كانت هناك حاجة إلى تركيز أكبر من العينة على اللوحة ، كرر ذلك حسب الحاجة في غرفة TLC. تأكد من أن الفتيل بأكمله أصبح مشبعا بالمذيب. ثم باستخدام ملقط أو ملقط ، ضع الألواح داخل غرفة TLC.

يجب ألا تلمس اللوحات الفتيل. قم بتغطية الغرفة واترك الألواح تتطور قبل أن تصل مقدمة المذيب إلى أعلى اللوحة. قم بإزالة الألواح من خزان TLC وقم بتمييز ارتفاع مقدمة المذيب بقلم رصاص.

دع الطبق يجف. في غطاء الدخان ، قم بتطوير أي ألواح TLC متبقية في نفس غرفة TLC ، والتي يمكن استخدامها بشكل عام ليوم كامل إذا ظلت مغلقة. إذا انخفضت كمية المذيب في الغرفة بشكل ملحوظ ، فقم بعمل المزيد من خليط المذيبات بعد أن تجف الألواح.

تصور العصابات تحت الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية. تعتبر غرفة المشاهدة المزودة بمصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة مريحة ، خاصة إذا كان بإمكان المصباح اكتشاف المركبات في كل من الأشعة فوق البنفسجية ذات الموجة القصيرة 254 نانومتر والأشعة فوق البنفسجية ذات الموجة الطويلة 365 نانومتر. استخدم قلم رصاص لتحديد العصابات باستخدام نظام توثيق صور هلام مزود بأضواء علوية أو مرئية للأشعة فوق البنفسجية أو المرئية للحصول على صور للوحايا.

أخيرا ، للمساعدة في توصيف النطاقات ، احسب عامل الاحتفاظ أو قيم التردد اللاسلكي عن طريق قياس المسافة التي يقطعها المركب أولا ، ثم قياس المسافة التي يقطعها المذيب وقسمة الأول على السلم. بمجرد تحديد مواقع الشريط ، يمكن تخزين اللوحات لوقت لاحق. استخدم في المقايسة الحيوية.

لف الأطباق بالبلاستيك وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. قم بتخزين الأطباق على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. يعتمد الحد الأقصى لوقت التخزين على استقرار المركب لأن السيليكا ليست محايدة.

قد تتحلل بعض المركبات أثناء وجودها على لوحة TLC. استعدادا لمقايسة السيرة الذاتية التلامسية ، قم بإعداد وتلقيح البكتيريا المنتجة للأمونيا المفرطة أو وسط HAB في ظل الظروف اللاهوائية. الثقافة المستخدمة في هذه الحالة هي Clostridium stickland Eye Strain sr.

قم بتنمية الثقافة إلى مرحلة أسية أو ثابتة عند 39 درجة مئوية. استخدم التقنيات اللاهوائية المعقمة عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. تحضير نقطة الصفر 75٪ الوزن لكل حجم.

أجار في نفس الوسط المستخدم لزراعة البكتيريا بعد انخفاض درجة حرارة الأجار إلى أقل من 60 درجة مئوية. قم بتلقيح الأجار المنصهر بنسبة 1٪ من الحجم لكل حجم من الثقافة واخلطه برفق ، ضعه على الفور في غرفة لاهوائية واسكبه في أطباق بتري بلاستيكية مقاس 15 × 100 ملم بالمقص. قطع لوحة TLC إلى مناطق تحتوي على الشريط أو النطاقات ذات الأهمية.

باستخدام شاربي تم وضع علامة على الجوانب الخلفية للوحاظ. ضع شريط TLC غير مستخدم على لوحة أجار كعنصر تحكم. ثم ضع الأربطة ووجهها لأسفل على ألواح أجار.

احتضان جانب أجار الألواح لأسفل في الغرفة اللاهوائية. حاضنة لمدة 24 ساعة عند 39 درجة مئوية بالملقط. قم بإزالة أحزمة TLC من ألواح الأجار أثناء وجودها في الغرفة اللاهوائية.

أضف tetra oleum الأحمر بالتنقيط على أسطح ألواح الأجار. اترك اللون يتطور لمدة 20 دقيقة على الأقل. عندما تتحول لوحة التحكم إلى اللون الأحمر تماما ، قم بإزالة الألواح من الغرفة اللاهوائية.

عصا المطثية لاندي هي بكتيريا لاهوائية ، لذلك ستبدأ في فقدان قابليتها للحياة فور إزالتها من الغرفة اللاهوائية ، لكن اللون مستقر لأكثر من 24 ساعة. باستخدام كاميرا رقمية ، قم بتصوير الألواح تحت الضوء المرئي على خلفية توفر تباينا كافيا. سيلاحظ اللون الأحمر الفاتح عندما تكون الخلايا الحية ملطخة.

الخلايا الميتة لا تلطخ. يتم عرض فصل السيليكا التمثيلية ، TLC لمستخلصات البرسيم الأحمر التي تحتوي على مركبات فينولية هنا. أدى الفصل في هكسان أسيتات الإيثيل تسعة إلى واحد على 8.5 سم إلى خمسة نطاقات ، أحدها تم حلها تماما من الأصل.

كانت المعايير التي تم تحميلها هي Formin Bio Canon A و Genine. تم تطبيق أربعة نطاقات من هذه اللوحة على الثقافات باستخدام عصا المطثية لاندي ، وهي بكتيريا فرط الأمونيا الكرشية تنتج البكتيريا لمدة 24 ساعة وملطخة باللون الأحمر رباعي الأوليوم كما هو موضح هنا. أدى الحضانة مع الفرقة واحدة Bio Canon A وجزء من الفرقة اثنين أربعة Monon nein على أجار البكتيريا المصنفة إلى منطقة تثبيط محددة جيدا.

ومع ذلك ، فإن حضانة ما تبقى من الفرقة الثانية ، جنبا إلى جنب مع النطاقين الثالث والرابع لم تمنع نمو البكتيريا. أظهرت هذه النتائج أن الكنسي الحيوي A كان مثبطا لرؤية نمو العين ، ولكن شكل نين لم يكن كذلك. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن هذه التقنية مرنة.

يمكن استخدام الكائنات الحية الدقيقة الأخرى للاختبار طالما تم اختيار الوسائط المناسبة ، ويتم تضمين عناصر التحكم للتأكد من توافق كيمياء الفصل وطريقة الكشف باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام تقنيات أخرى مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء وقياس الطيف الكتلي للمساعدة في توصيف المركبات المضادة للميكروبات المحددة في المقايسة الحيوية.