تحليل شامل لديناميات النسخ من عينات المخ بعد تجربة السلوكية

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة ديناميكيات النسخ وتحديد نوى الدماغ للفئران بعد التجربة السلوكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعويد أولا وتسجيل نشاطها الحركي بعد حقن المحلول الملحي. بمجرد التعود ، يتم تسجيل النشاط الحركي بعد جرعة واحدة من الكوكايين ، ثم يتم جمع عينات من النواة المتكئة واستخدامها لعزل الحمض النووي الريبي وإعداد CDNA.

بعد ذلك ، يتم إجراء تحليل QPCR من أجل دراسة التعبير الجيني الناجم عن السلوك. في النهاية ، يتم الحصول على النتائج التي تظهر ديناميكيات النسخ بعد تجربة الكوكايين ، ويوضح البروتوكول الدكتور هاتو ، مدير المختبر ، ودوم موير ، طالب دراسات عليا من المختبر ودوران طالب جامعي من المختبر لمدة ثلاثة أيام متتالية. اعتاد كل فأر على إجراءات المناولة والحقن ، وتنظيم الفئران في أقفاص قبل بدء التجربة ، بحيث لن يتم نقل الفئران بين الأقفاص في المستقبل ولن تترك الفئران في عزلة لفترة طويلة من الزمن.

قبل 30 دقيقة من بدء الاختبار ، يجب نقل جميع أقفاص الاختبار إلى الغرفة السلوكية للسماح للحيوانات بالتأقلم مع البيئة. قم بإعطاء حقنة داخل الصفاق من 250 ميكرولتر من محلول ملحي مباشرة بعد الحقن ، ضع الفأر في غرفة سلوك لمراقبة النشاط الحركي لمدة 15 دقيقة. يمكن وضع الماوس في غرفة السلوك لمدة 20 دقيقة.

مراقبة نشاط من الدقيقتين الثانية إلى الساعة 17. كرر هذه الخطوات في نفس الوقت من اليوم خلال اليومين التاليين. في اليوم الرابع ، قم بإعطاء حقنة واحدة من الكوكايين أو المحلول الملحي ، اعتمادا على المجموعة ، ووضع الفأر على الفور في الغرفة لمراقبة النشاط الحركي الموضعي لمدة 20 دقيقة في نقاط زمنية محددة بعد التعرض للكوكايين ، واستخرج الدماغ ووضعه في برد مثلج ، محلول السائل الدماغي النخاعي لمدة دقيقة إلى دقيقتين ليبرد ويتصلب

بعد إزالة المخيخ والتخلص من السوائل الزائدة ، قم بلصق الدماغ بمرحلة الاهتزاز بحيث يكون الجزء المنقاري متجها لأعلى. املأ الغرفة بالسائل البارد A السائل الدماغي النخاعي وقم بتقطيع أقسام 200 ميكرون حتى يتم تحديد النواة المتكئة بوضوح. انتبه جيدا لشكل الجسم الثفني وموقع وشكل العمولة الأمامية والبطينين أثناء القطع.

بمجرد تحديد المنطقة الصحيحة ، قم بتقطيع قسمين من 400 ميكرون سيتم تشريح النواة المتكئة منها تحت مجسم استخدم شفرة رفيعة لتشريح النواة المتكئة بعيدا عن الشرائح. يجب أن تعزل أربع تمريرات سريعة للشفرة في المنطقة الصحيحة الأنسجة المناسبة على الفور.

ضع الأنسجة المعزولة في 900 ميكرولتر من كاشف التحلل ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى استخراج الحمض النووي الريبي لبدء إذابة الأنابيب عند 37 درجة مئوية والتجانس. باستخدام إبرة قياس 25 ، قد تكون الجولات القليلة الأولى صعبة وتتطلب دفع الأنسجة على جدار الأنبوب لتجانسها إلى قطع صغيرة. لضمان التجانس المناسب، ضع الماصة على عمود الدوران الصغير لتقطيع كايا وجهاز الطرد المركزي.

ماصة المحللة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد تنقية الحمض النووي الريبي ، يتم إجراء النسخ العكسي إلى CDNA بالإضافة إلى التضخيم المسبق المستهدف للعينات باستخدام بادئات موجهة ضد مجموعة الجينات المختارة للتحليل. يتم وصف هذه الإجراءات في النسخة النصية من البروتوكول.

رقائق الموائع الدقيقة التجارية لتحليل QPCR الشامل في 48 × 48. التنسيق ، مما يتيح تحليل 48 عينة مع 48 مجموعة مسبار ، أو بتنسيق 96 × 96 حيث يتم تحليل 96 عينة باستخدام 96 مسبارا. في معظم الحالات ، يعتمد اختيار الرقاقة بشكل أساسي على عدد العينات التي تم تحليلها.

أولا ، قم بإعداد مزيج العينة وفقا للشريحة المختارة للتجربة. توخ الحذر عند سحب كاشف تحميل عينة صبغة ملزمة 20 XDNA. قم بتحريك محاليل خلط العينات لمدة لا تقل عن 20 ثانية وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية على الأقل.

يمكن تخزين التفاعلات المحضرة لفترات قصيرة عند أربع درجات مئوية حتى تصبح الشريحة جاهزة للتحميل. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج الفحص ، وقم بتحريك مزيج العينة جيدا وجهاز الطرد المركزي لتدوير جميع المكونات. كما هو موضح سابقا ، تحتوي شريحة المصفوفة الديناميكية IFC على مداخل للعينات والمقايسات ، بالإضافة إلى مداخل محددة لسائل خط التحكم المستخدم لضغط غرف الموائع الدقيقة.

أولا ، قم بحقن سائل خط التحكم في كل مجمع على الشريحة. بعد ذلك ، قم بتجهيز الشريحة عن طريق وضعها في وحدة تحكم IFC وتشغيل البرنامج النصي المناسب. عند الانتهاء من البرنامج النصي، قم بإزالة الشريحة المعدة من وحدة التحكم في IFC وقم بتعبئة خمسة ميكرولترات من كل فحص.

تخلط على الرقاقة. أضف خمسة ميكرولترات من كل مزيج عينة إلى مداخلها وأعد الشريحة إلى وحدة التحكم IFC باستخدام برنامج وحدة التحكم IFC. قم بتشغيل البرنامج النصي لتحميل العينات والمقايسات في الشريحة.

عند الانتهاء من البرنامج النصي لمزيج التحميل، قم بإزالة الشريحة المحملة من وحدة التحكم IFC. بعد ذلك ، قم بتحميل الشريحة على جهاز التدوير الحراري وقم بإنشاء شريحة جديدة تتضمن تحليل منحنى الذوبان. يضمن استخدام برنامج التدوير الحراري التعرف على غرف التفاعل بشكل صحيح والسماح للتفاعل بالانتهاء من الانتهاء.

كانت زيادة في النشاط الحركي واضحة بعد حقنة الكوكايين الحادة الواحدة. في هذا القسم الإكليلي ، حددت الخطوط البيضاء السميكة موقع القطع التي تم إجراؤها لتحديد حدود النواة المتكئة. أثناء التشريح ، توضح منحنيات تضخيم البادئات الموجهة ضد المديرين الماليين و phos B أن أزواج التمهيدي تضخم نصها المستهدف بكفاءة 100٪ تقريبا.

في كل دورة ، تظهر النتائج أن التعبير الناجم عن الكوكايين للمديرين الماليين والفوس ب في النواة المتكئة كان أعلى بعد ساعة وساعتين من التعرض. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي من أجل تحديد نسخة جديدة غير مميزة.