الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تغيرات مثيلة DNA والتعبير الجيني عند التعرض للإجهاد في بداية الحياة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إخضاع جراء الفئران حديثة الولادة للفصل عن الأم لتحفيز الإجهاد في بداية الحياة، وفي خطوة ثانية يتم الحصول على مناطق الدماغ ذات الاهتمام هنا، وهي النواة جنيبة البطينية (PVN)، عن طريق التشريح الدقيق في الموقع، مع عزل DNA وRNA في آن واحد من عينة نسيجية واحدة.

بعد ذلك، يتمت معالجة الحمض النووي (DNA) المستخلص بـ sulfite، ويُضخم الجزء المطلوب دراسته بواسطة bi sulfite PCR. ثم يتم ربط هذا الجزء في ناقل (vector) وتحويله إلى البكتيريا. ويتم تحديد عمليات التحويل الناجحة من خلال التعبير عن العلامات المحددة وحجم قطعة PCR.

وأخيراً، يُستخدم تسلسل البيسلفيت لتقييم حالة الميثيلة. وتكمن الميزة الرئيسية لسير العمل هذا في أنه يتيح تحليلاً ميسراً للبرمجة فوق الجينية استجابةً للمؤثرات البيئية. ويمكن لهذه الطريقة أن تقدم رؤية متعمقة حول البرمجة فوق الجينية الناتجة عن الشدائد في المراحل المبكرة من الحياة.

ويمكن تطبيق ذلك أيضاً على أنظمة أخرى؛ حيثما يتم تحليل عملية الميثيلة والتعبير الجيني في بيئة عالية التخصص النسيجي، وحيثما تكون وفرة الأنسجة محدودة. ولحث الإجهاد في مرحلة الحياة المبكرة، يتم إجراء الفصل الأمومي لصغار الفئران من أمهات من سلالة C 57 black six N حاملة في توقيت محدد لإحداث الفصل الأمومي.

يُنقل كل بطن من المواليد إلى قفص نظيف ومدفأ لمدة ثلاث ساعات يومياً من اليوم الأول إلى اليوم العاشر بعد الولادة، مع ترك جراء المجموعة الضابطة غير المعرضة للإجهاد دون إزعاج. وباستثناء فترة الفصل التي تستغرق ثلاث ساعات، تُترك جميع المواليد مع أمهاتها حتى الفطام في اليوم 21 بعد الولادة. بعد ذلك، يتم إيواء الجراء في مجموعات متجانسة من حيث الجنس، بمعدل ثلاثة إلى خمسة فئران في كل قفص تحت ظروف إيواء قياسية. ولبدء عملية جمع أنسجة الدماغ، تُنزع أدمغة الفئران من الجماجم ويتم تجميدها فوراً في الثلج الجاف (isop dry ice) وتُخزن عند -80 درجة مئوية.

عندما يحين وقت جمع عينات الأنسجة المقتطعة، أخرج الأدمغة من المجمد عند درجة حرارة -80°C وضعها على الثلج الجاف. ابدأ بإجراء تقطيع تجميدي للأدمغة إلى مقاطع إكليلية بسمك 10 micron من المنقاري إلى الذنبي. ثم ثبّت المقاطع على شرائح زجاجية من نوع super frosts وجففها استعداداً لصبغ الكريستال البنفسجي.

يمكن أخذ شرائح إضافية وتخزينها عند درجة حرارة -20 °C لإجراء تحليلات أخرى، مثل التهجين الموضعي (in situ hybridization). وعندما يحين وقت أخذ العينات، تُصبغ الشرائح بصبغة البنفسج البلوري (crystal violet) لتحديد هياكل الدماغ المستهدفة. ثم وباستخدام إبرة ثقب، تُؤخذ عينات ثقب بقطر 0.8 mm من المناطق المستهدفة باستخدام التشريح المجهري الموضعي (in loco microdissection).

يجب تخزين العينات المأخوذة بالثاقب عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. ومن الأهمية بمكان إجراء عملية الثقب الدقيق بطريقة معيارية، حيث أن التعبير الجيني والمثيلة يكونان محددين للغاية حسب نوع النسيج. قم بمجانسة العينات في 400 µL من محلول qadium thiocyanate المنظم باستخدام ماصة، ثم قم بعملية الرج الدوامي في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، مرر ناتج التحلل عبر سرنجة قياس 29. كرر هذه العملية عدة مرات حتى لا يعود هناك أي تكتلات مرئية. ثم قسم ناتج التحلل إلى أجزاء متساوية.

أحدها لمعالجة RNA، والتي يجب القيام بها أولاً، والأخرى لمعالجة DNA، والتي يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى يتم الانتهاء من معالجة RNA. لتنقية RNA، يتم استخدام حجم واحد من عشرة (1/10) من أسيتات الصوديوم، وحجم واحد من aqua phenol، ونصف حجم من كلوروفورم إلى أيزواميل بنسبة 24:1. قم برج الخليط بقوة باستخدام جهاز الـ vortex بعد كل إضافة، ثم حضن المزيج النهائي على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بطرد الخليط مركزياً.

اجمع الطور المائي وأضف إليه حجماً مساوياً من الإيثانول بتركيز 70%. باستخدام مجموعة أعمدة تدوير RNA، قم بإجراء عملية هضم الـ DNA على العمود، ثم اغسل واستخلص الـ RNA في 25 µL من الماء.

قم الآن بتنقية الـ DNA باستخدام بروتوكول مجموعة أدوات مُعدل ليشمل إضافة عملية هضم الـ RNA، وتدفئة محلول الاستخلاص وعمود الاستخلاص إلى 70 درجة Celsius قبل استخدامهما. وتكفي مدة 10 دقائق عند 70 درجة Celsius بالنسبة للأعمدة. وأخيراً، استخدم جهاز المطياف الضوئي لتحديد تركيزات الـ DNA والـ RNA.

تنتج عينة خزعة نمطية من النواة الجارامعدة (PVN) حوالي 600 نانوجرام من DNA وحوالي 400 نانوجرام من RNA؛ يتم تخصيص 100 نانوجرام تقريبًا من RNA لتحليل التعبير الجيني بواسطة PCR الكمي قبل التضخيم باستخدام السلفيت. يتم معالجة 200 نانوجرام من DNA المعزول باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجاريًا لتضخيم DNA من المناطق الميثيلية. اطلب بادئات مصممة خصيصًا لـ DNA المحول بواسطة البيسلفيت؛ حيث يعد التصميم الأمثل للبادئات في bi PCR أمرًا ضروريًا، لأن جودة ونوعية ناتج تضخيم PCR تحدد مدى نجاح الخطوات التالية.

عند وصول البادئات، حدد درجة الحرارة المثلى ودرجة حرارة التخمير من خلال تجارب استطلاعية. استخدم 2 µL من الحمض النووي DNA المعالج بالبيسلفيت كقالب لكل مزيج PCR بحجم 25 µL.

قم بتضخيم الخليط بدءاً بعملية مسخ لمدة ست دقائق عند 95 درجة مئوية، تليها من 45 إلى 50 دورة تضخيم، قبل مرحلة استطالة نهائية لمدة خمس دقائق عند 72 درجة مئوية. قم بتحليل سبعة µL من ناتج PCR عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز للتحقق من حجم القطعة المضخمة. قم بتنقية ما تبقى من ناتج PCR لاستخدامه في عملية الربط اللاحقة باستخدام مجموعة تنقية PCR متاحة تجارياً.

في حال الحصول على نواتج PCR غير مرغوبة، استخدم تنقية الهلام لعزل الناتج المطلوب لهذا البروتوكول. يتم استخدام طقم استنساخ تجاري، وتعتمد كفاءة الاستنساخ بشكل حاسم على القطعة المدرجة (insert).

لذلك، إذا تم الحصول بشكل متكرر على أعداد منخفضة من المستنسخات المؤشبة، فجرب ناقل استنساخ مختلفاً. قم بإعداد تفاعل ربط بحجم 10 µL باستخدام 1 µL من الناقل و3 µL من ناتج PCR المنقى. اخلط التفاعل عن طريق السحب والضخ بالممص، ثم حضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C حتى اليوم التالي.

قم بتنقية تفاعل الربط عن طريق الترسيب التقليدي بالإيثانول، ثم قم بتحويل البكتيريا باستخدام الناتج. أضف 1 ml من وسط SOB المجهّز مسبقاً بالتدفئة مباشرة بعد عملية النبض الكهربائي، وانقل البكتيريا المحولة إلى أنبوب تفاعل. بعد استرجاع البكتيريا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، انشر 100 µL من كل معلق على طبق LB ampicillin مغطى بـ IPTG.

يتم تحضين الأطباق طوال الليل حتى يمكن التقاط المستعمرات. يتم إعداد تفاعلات PCR للمستعمرات بحجم 25 µL في طبق يحتوي على 96 بئراً، مع استخدام 3 µL من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 2.5 mM في كل تفاعل. يتم التقاط المستعمرات البيضاء الموجبة باستخدام رأس ماصة ونقلها إلى مزيج PCR عن طريق غمسها ببساطة.

ابدأ تفاعل PCR بدورة صهر لمدة أربع دقائق. اتبع ذلك بـ 10 دورات تضخيم عند درجة حرارة ربط تبلغ 56 °C. مدة كل خطوة من هذه الدورات هي 30 ثانية.

بعد ذلك، خفّض درجة حرارة التلدين إلى 48 °C لمدة 30 دورة تضخيم إضافية. واختتم العملية بدورة تمديد مدتها خمس دقائق. الآن، قم بتحميل 5 µL من كل منتج على هلام Agarose وحدد التفاعلات التي تحتوي على قطعة مدرجة بالحجم الصحيح.

استخدم طقم تنقية متاح تجاريًا لتنقية نواتج الـ PCR المطلوبة بحيث يمكن تسلسلها باستخدام طريقة BigDye Terminator cycling sequencing. في طبق يحتوي على 96 بئرًا، قم بتعبئة الآبار بـ 3 µL من المزيج الرئيسي للتفاعل BigDye، يليه 2 µL من ناتج PCR المستعمرات المنقى. قم بتشغيل التفاعل في جهاز الدورات الحرارية (thermocycler) بدءًا من دقيقة واحدة عند 96 °C، تليها 35 دورة تتكون من 10 ثوانٍ عند 96 °C، و5 ثوانٍ عند 50 °C، وأربع دقائق عند 60 °C.

بعد الانتهاء من تفاعل big die، قم بتنقية التفاعل باستخدام لوحة تنقية big die. بعد الحصول على التسلسلات، قم بتحليلها باستخدام online big analyzer أو أداة B-I-S-M-A لاستخلاص نمط الميثيلة في منطقة DNA المدروسة، وذلك لفهم تأثير الضغط النفسي في بداية الحياة أو ELS على تعبير a VP وحالة الميثيلة. تم التعامل مع فئران C 57 black sticks وفقاً للبروتوكول الموصوف، حيث تم ثقب النواة جانب البطينية والنواة فوق البصرية لعزل DNA و R-N-A-D-N-A، ثم عولج DNA بالبيسلفيت، وتم تضخيمه باستخدام بادئات متخصصة لمعزز a VP، ثم استنسخت نواتج PCR وتم تسلسل ما لا يقل عن 20 مستنسخاً معاداً تركيبه من كل فأر.

تم تحليل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد ترددات الميثيلة لـ CPGs الموجودة في ناتج تضخيم PCR في أنسجة من P-V-N-E-L-S، والتي أحدثت نقص ميثيلة ملحوظاً في أربعة مواقع على معزز A VP، مما يشير إلى وجود وسم فوق جيني لهذه المنطقة التنظيمية من خلال تجارب الحياة المبكرة. وعلى عكس PVN، لم تتأثر ميثيلة معزز A VP بفعل ELS في SON، مما يوضح خصوصية الأنسجة للتأثير فوق الجيني؛ وفي حيوانات المجموعة الضابطة، ارتبطت حالة ميثيلة DNA عند CPG 10 ارتباطاً عكسياً مع تعبير جين a VP، مما يشير إلى دور ميثيلة DNA في الضبط الدقيق لتعبير جين a VP. عقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل UPCR بسهولة على RNA المعزول للإجابة على أسئلة إضافية مثل التغيرات في تعبير الجينات في الأنسجة التي تم تحليلها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية دراسة تغيرات مثيلة DNA استجابةً للمؤثرات البيئية أو تلك المعتمدة على الخبرة.