الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم أنواع مختلفة من الجزيئات ذات المغزى بيولوجيا بطريقة متسلسلة ويمكن التحكم فيها بالجرعات بكفاءة عالية باستخدام مسام الموائع الدقيقة بمساعدة Vortex ، ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر بشكل فردي تحتوي على محاليل DPBS مع الخلايا والجزيئات الحيوية ، وربط كل أنبوب بحامل القارورة الخاص به المتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي. الخطوة الثانية هي إدخال أنابيب المدخل من كل قارورة في جهاز الموائع الدقيقة باستخدام الأقطاب الكهربائية المكونة من 15 سنا. بعد ذلك ، يتم تدفق الخلايا إلى الجهاز حيث يتم احتجازها في دوامات دقيقة تشكلت في غرف التثقيب الكهربائي.

الخطوة الأخيرة هي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة على الخلايا المحاصرة على الفور متبوعة بحقن المحاليل التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ليتم تسليمها إلى العصارة الخلوية. في النهاية ، يمكن إطلاق الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه العملية وجمعها لتحليلها في اتجاه المصب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن التقنية المقترحة قادرة على توصيل كمية خاضعة للرقابة بالتتابع من جزيئات متعددة إلى مجموعة خلايا متطابقة محددة مسبقا بكفاءة عالية وقابلية للبقاء.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تبادل السوائل لأن توقيت خطوة التدفق البارد في كل محلول. تحدد خطوة التبديل استقرار التراكب اللوني للخلية. سيتم استخدام خط خلية سرطان الثدي النقيلي M-D-A-M-B 2 31 في لوحة التجربة هذه مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر بحجم 10 ملليلتر لكل T 75 قارورة زراعة الأنسجة في وسط Leibovitz's L 15 مكمل بنسبة 10٪ حجم لكل حجم ، ومصل بقري للجنين ، و 1٪ بنسلين.

يحتضن الستربتومايسين الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع بيئة 0٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين من البذر ، حصاد الخلايا للتجارب. بعد غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن لفوسفات بوكوس أو DPBS ، عالج الخلايا بنسبة 0.25٪ تريبسين في EDTA لمدة دقيقتين.

أضف ثمانية ملليلتر من وسائط النمو لتعطيل خلايا الحبيبات ذات النشاط الأنزيمي عن طريق الترقي لمدة خمس دقائق عند 200 مرة G والوسائط المعلقة إلى تركيز نهائي من خمسة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. لن يتم عرض تصميم وتصنيع جهاز التثقيب الكهربائي للموائع الدقيقة في هذا الفيديو ، ولكن تم وصفه في المخطوطة المصاحبة. يتكون النظام من مداخل للخلايا والجزيئات ومحلول التدفق.

قناتان مستقيمتان حيث يحدث التركيز بالقصور الذاتي. 10 غرف للتثقيب الكهربائي مع أقطاب كهربائية ومخرج لإعداد تجارب التدفق. أدخل منفذا أو بولي إيثر أو كيتون الأثير أو أنبوب الذروة ، وقطب الألمنيوم المكون من 15 سنا للنبض القصير ، وتطبيق الجهد العالي في الأماكن المحددة عبر الفتحات الموجودة في القناة الدقيقة.

يتكون القطب الكهربائي المكون من 15 سنا من 10 أقطاب كهربائية موجبة وخمسة أقطاب كهربائية سالبة. يفصل كل قطب موجب مسافة 1.5 ملم عن القطب السالب ، وكل قطب كهربائي من نفس القطبية متباعدة بمقدار 1.35 ملليمتر. قم بتوصيل المعدات الكهربائية لتوليد نبضات الموجة المربعة القصيرة عالية الجهد بأقطاب الألمنيوم الملامسة للمحاليل المتدفقة.

في قالب PDMS ، يجب أن تتكون المعدات من مولد نبض ومضخم جهد عالي مدمج. قم بإعداد أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر تحتوي بشكل فردي على DPBS ومحاليل بالخلايا والجزيئات. قم بتوصيل كل أنبوب بحامل القارورة الخاص به المتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي.

قم بتوصيل أنابيب ذروة المدخل من حاملات القارورة بفتحات المدخل المعنية في جهاز الموائع الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتعيينه. حجم نبضات الموجة المربعة فولت إلى 100 فولت.

من أجل أن تكون شدة المجال الكهربائي عبر غرفة التثقيب الكهربائي مكافئة ل 0.7 كيلو فولت لكل سنتيمتر. اضبط منظم الضغط على 40 PSIA يتم استخدام مصدر نيتروجين فردي قابل للتعديل يدويا للضغط بشكل موحد على جميع قوارير العينة ويستخدم مشعبا عالي السرعة لتنشيط منافذ المحلول الفردية في الوقت المناسب. باستخدام برنامج عرض المختبر المصمم خصيصا للتحكم في الصمام.

افتح برنامج عرض المختبر المسمى مشغل الصمامات وانقر فوق تشغيل من القائمة المنسدلة بعنوان تشغيل. انقر فوق صمام رمز الصمام المقابل واحد لفتح الصمام لخزان DPBS لتجهيز سرعة التدفق المطلوبة لتوليد دوامة محاصرة الخلايا المستقرة لمدة 1.5 دقيقة. يجب أن تتحول أيقونة الصمام من الرمادي إلى الأخضر عند تنشيط التدفق ، كل من حلول الغسيل والخلايا من خلال الجهاز في وقت واحد لمدة 10 ثوان قبل خطوة محاصرة الخلية.

لضمان التدفق غير المنقطع أثناء خطوة تبديل الحل، يجب تكرار خطوة التدفق المشترك الموجزة هذه في كل خطوة تبديل الحل. قم بتبديل منفذ المحلول النشط من محلول الغسيل إلى محلول الخلية لاحتجاز الخلايا في حجرة التثقيب الكهربائي لمدة 30 ثانية. في هذا الفيلم ، تمثل إشارات الفلورسنت الزرقاء خطافات قابلة للحياة.

3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 5 خلايا مرحلة. قم بتشغيل منفذ الغسيل وشطف الجهاز لمدة 20 ثانية. من أجل إزالة الخلايا الملوثة غير المحاصرة ، يتدفق المحلول الذي يحتوي على الجزيء الأول ذي الأهمية.

يوديد البروبيديوم في الجهاز لأغراض التصور. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام أصباغ الحمض النووي بدلا من خيوط DExT الموسومة بالفلورسنت بسبب نسبة الضوضاء إلى الإشارة الفائقة للأصباغ ، وتطبيق خمس نبضات قصيرة على الفور بعد حقن المحلول الجزيئي ، ومراقبة حجم وعدد النبضات الكهربائية المطبقة في الوقت الفعلي باستخدام راسم الذبذبات ، ويمكن تصور إشارات الفلورسنت للجزيئات تحت المجهر ، احتضان الخلايا لمدة 100 ثانية في المحلول الجزيئي. التدفق التالي ، المحلول الذي يحتوي على الجزيء الثاني ، صبغ الحمض النووي يويو واحد في الجهاز.

في هذا العرض التوضيحي ، يتم تسليم الجزيء الثاني دون تطبيقات نبضية كهربائية إضافية. يؤكد هذا الفيلم أن الخلايا تعبر الآن عن جميع إشارات الفلورسنت الثلاث. أخضر لليويو ، واحد ، أحمر للبروبيديوم ، يوديد ، وأزرق للخطافات.

3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 5. حرر الخلايا في لوحة 96 بئر لتحليلها في اتجاه مجرى النهر عن طريق خفض ضغط التشغيل إلى أقل من خمسة رطل لكل بوصة مربعة. يتم جمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من المحلول مع 100 خلية من كل إصدار.

يجب تكرار إجراء التثقيب الكهربائي ثلاث مرات على الأقل لجمع خلايا كافية لجهاز الطرد المركزي لقياس التدفق الخلوي. تحتوي لوحة البئر 96 على خلايا معالجة عند 228 مرة G لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات الفلورسنت الزائدة وأعد تعليق الخلايا في DPBS.

إذا تم تسليم خيوط DExT الموسومة بالفلورسنت ، تحليل الخلايا لاحقا لامتصاص الجزيئ. الكفاءة عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تحديد التسليم الجزيئي الناجح نوعيا من خلال مراقبة التغيرات في شدة التألق للخلايا المدارية المدارية الكهربائية في C two ، مما أكد أن 90٪ من الخلايا المعالجة تمتص 70،000 دالتون ، وهو جزيء حبلا DExT أيوني.

تختلف كفاءة كل جزيء ديكستران تم نقله على أنه نسبة عدد الخلايا التي تمتص بنجاح الجزيء محل الاهتمام إلى العدد الإجمالي للخلايا المعالجة بشكل كبير اعتمادا على الوزن الجزيئي أو الشحنات الكهربائية. تم تسليم جميع جزيئات ديكستران المختبرة إلى العصارة الخلوية بكفاءة تزيد عن 70٪ كما هو موضح هنا ، ملامح قياس التدفق الخلوي التمثيلية للخلايا التي لم يتم معالجتها بالتثقيب الكهربائي. يتم تعيين عتبة الفلورسنت التي تشير إلى التسليم الجزيئي الناجح من البيانات بحيث يتم العثور على الإشارات من عينات التحكم تحت العتبة.

تعرض بيانات قياس التدفق الخلوي التمثيلية هذه للخلايا المثقبة بالكهرباء بالتتابع مخطط قياس التدفق الخلوي بجوار صور خط الفلورسنت ، وتمثل المربعات الخضراء إشارات من الخلايا التي تمتص 3000 ، ودالتون ديكستران محايد فقط ، وتمثل المربعات الحمراء إشارات من الخلايا. امتصاص 3000 دالتون ، وهو خيط DExT أيوني ، فقط إشارات الفلورسنت من الخلايا التي تمتص ، يشير كل من جزيئات حبلا DExT الموضحة باللون الأصفر إلى كفاءة توصيل جزيء مزدوج بنسبة 56٪ بعد تطويره. ستكون هذه التقنية مفيدة للباحثين في مجال الطب والتكنولوجيا الحيوية وعلم الأدوية لاستكشاف مزيج من الكواشف العلاجية لتحقيق تأثيرات تآزرية في علاج الأمراض المعقدة.

لا تنس أن العمل مع النبضات الكهربائية عالية الجهد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ضمان تأريضك أثناء تنفيذ هذا الإجراء.