كهرباء خالية من الحمض النووي متسلسل وعزل بروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR والبروتينات التفاعلية مناعيًا من عينة ما دون الحاجة إلى كهرباء أو بنية تحتية مختبرية. يبدأ عزل الأحماض النووية والبروتينات بخلط العينة مع الغوانيدين والثيوسيانات لتحليل العينة، ثم تمرير الخليط عبر المادة الممتصة في ماصة الاستخلاص. بعد التمرير الخامس والنهائي عبر المادة الممتصة، يُوضع الخليط في محلول استخلاص البروتين، ويُترك جانبًا لعزل البروتين التفاعلي مناعيًا.

بعد ذلك، يتم غسل المادة الممتزة والأحماض النووية المرتبطة بها عن طريق تمرير 95% ethanol فوق المادة الممتزة. ثم يتم تجفيف المادة الممتزة والأحماض النووية المرتبطة بها لعدة مرات عن طريق تمرير الهواء المحيط فوق المادة الممتزة لمدة خمس دقائق. وتتمثل الخطوة النهائية لعزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR في استرداد الأحماض النووية من المادة الممتزة باستخدام 250 µL من tris أو محلول مائي مماثل آخر لعزل البروتين التفاعلي مناعياً.

بعد خلط العينة مع محلول استخلاص البروتين المنظم، استخدم ماصة استخلاص ثانية ومرر الخليط فوق المادة الماصة 15 مرة. الخطوة التالية هي غسل المادة الماصة والبروتين المرتبط بها عن طريق تمرير 95% ethanol فوق المادة الماصة لعدة مرات. بعد ذلك، يتم تجفيف المادة الماصة والبروتين المرتبط بتمرير الهواء المحيط فوق المادة الماصة لمدة خمس دقائق.

تتمثل الخطوة النهائية من البروتوكول في استخلاص البروتين من المادة المازة. وفي النهاية، تتيح ماصة الاستخلاص المستخدمة في هذا الإجراء عزل الأحماض النووية الجاهزة لتفاعل PCR والبروتينات التفاعلية مناعيًا دون الحاجة إلى الكهرباء. مرحبًا، اسمي ديف باولوفسكي.

أنا باحث علمي أول في شركة Kubrick Incorporated في بوفالو، نيويورك، وسوف نتعلم اليوم تقنية تتيح عزل كل من البروتينات والأحماض النووية بالتتابع دون الحاجة إلى جهاز طرد مركزي أو جهاز رج (vortex) أو أي معدات مختبرية خارجية أخرى. قبل تحليل العينة، تأكد من أن العينات في حالة سائلة. إذا كانت العينة صلبة، مثل الطعام أو البراز، فيجب تعليق العينة في وسط سائل مثل الماء أو المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (PBS).

امزج 500 µL من العينة مع 500 µL من غوانيدين ثيوسيانات بتركيز 6 M في أنبوب سعة 1.5 mL. بعد ذلك، اضغط على بصلة ماصة الاستخلاص لطرد الهواء المحيط. اسحب عينة الـ 1 mL كاملة إلى ماصة الاستخلاص عبر المادة الماصة عن طريق السماح للبصلة بالتمدد ببطء.

اقلب أداة الاستخلاص بحيث تتدفق حبيبات المادة الماصة والعينة إلى البصيلة. اطحن حبيبات المادة الماصة مع العينة داخل البصيلة، مع الحرص على عدم دفع العينة خارج ماصة الاستخلاص.

اقلب ماصة الاستخلاص، ثم أفرغ العينة في الأنبوب الأصلي سعة 1.5 milliliter. اسحب عينة الـ one milliliter بالكامل إلى ماصة الاستخلاص، مع تمريرها فوق المادة الماصة بمعدل متوسط. مع الحرص على إبقاء المادة الماصة في عنق ماصة الاستخلاص، أفرغ العينة بالكامل في الأنبوب سعة 1.5 milliliter عن طريق الضغط على البصلة.

كرر هذه العملية، مع تمرير العينة فوق المادة الماصة أربع مرات إضافية، ليصبح المجموع خمس تمريرات. بعد التمريرة الخامسة فوق المادة الماصة، قم بتفريغ عينة الـ 1 milliliter بالكامل في 4 milliliters من منظم استخلاص البروتين في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. اخلط الأنبوب عن طريق قلبه، ثم أغلقه واتركه جانباً للاستخدام لاحقاً.

اغسل الأحماض النووية المعزولة بتمرير 1 mL من الإيثانول بتركيز 95% فوق المادة الماصة ثلاث مرات، مع إعادة الإيثانول إلى أنبوبه الأصلي. وعند التمريرة النهائية، كرر عملية الغسل ثلاث مرات باستخدام 1 mL ثانٍ من غسول الإيثانول بتركيز 95%. الخطوة التالية من الإجراء هي تجفيف المادة الماصة، حيث يتم استرجاع الحمض النووي بشكل أفضل عندما تكون المادة الماصة جافة.

أدرك أن هذه الخطوة مرهقة، ومع ذلك، فإن إكمالها ضمن الإطار الزمني الموصى به سيؤدي إلى تحسين نتائجك. اضغط على الممصّة ثم حررها لمدة خمس دقائق.

مرر الهواء المحيط عبر ماصة الاستخلاص لتجفيف الأحماض النووية والطبقة الماصة، ثم امسح بقايا الإيثانول من طرف ماصة الاستخلاص. وباستخدام منديل Kim wipe، استعد الأحماض النووية عن طريق تمرير 250 µL من محلول triss بتركيز 10 mM فوق المادة الماصة خمس مرات. يمكن استبدال محلول triss المنظم بأي محلول مائي مناسب آخر مثل PBS.

يحتوي المحلول الناتج على الأحماض النووية المستخلصة؛ ولإجراء استخلاص البروتين أولاً، امزج العينة في محلول استخلاص البروتين الذي تم تنحيته مسبقاً عن طريق قلب الأنبوب، ثم مرر ما يقرب من 2 إلى 3 ملليلتر من هذه العينة التي يبلغ حجمها 5 ملليلتر فوق المادة الماصة لماصة استخلاص جديدة. قم بتفريغ العينة بأكملها في نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر، مع الحرص على إبقاء المادة الماصة في عنق ماصة الاستخلاص.

كرر هذه العملية، مع تمرير العينة فوق المادة الممتزة 15 مرة. اغسل المادة الممتزة والبروتين المرتبط بتمرير 1 mL من 95%Ethanol فوق سرير المادة الممتزة ثلاث مرات، مع تفريغ الإيثانول في أنبوبته الأصلية، ثم اغسله ثلاث مرات إضافية باستخدام 1 mL ثانٍ من 95%ethanol.

الخطوة التالية من الإجراء هي تجفيف المادة الماصة مرة أخرى. وكما هو الحال مع الأحماض النووية، فإن استعادة البروتين تتم بشكل أفضل عندما تُجفف المادة الماصة لفترة زمنية أطول.

اضغط على الماصة ثم حررها لمدة خمس دقائق، لتمرير الهواء المحيط عبر ماصة الاستخلاص. ولتجفيف سرير ممتز البروتين، امسح بقايا الإيثانول من طرف ماصة الاستخلاص. وباستخدام منديل Kim wipe، استعد البروتين عن طريق تمرير 250 µL من PBS فوق الممتز خمس مرات.

يمكن استبدال محلول PBS المنظم بأي محلول مائي آخر مناسب، مثل 10 millimolar tris، وبقيمة pH 6.8. ويحتوي المحلول الناتج على المحتوى البروتيني للعينة. كما تم تضخيم جينات سموم الشيجا المرتبطة بسلالة entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven E DL 9 33 من خلال إجراء استخلاص البروتين والحمض النووي باستخدام ماصة الاستخلاص.

توجد جينات سم شيجا، سم شيجا واحد وسم شيجا اثنين، على عاثيات بكتيرية معتدلة شبيهة بـ lambda وعاثيات بكتيرية معيبة تحت تحكم المحفز PR. ويؤدي تنشيط استجابة SOS في بكتيريا e coli إلى حث العاثيات الأولية و/أو إنتاج السموم. وفي هذه الحالة، هناك زيادة كبيرة في تضخيم جين سم شيجا اثنين عندما يتم حث استجابة SOS بواسطة mitomycin C مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة.

يشير هذا إلى تحفيز العاثيات الكامنة (prophage) وتضاعف جينوم العاثية. البروتين المستخلص من تجارب عزل البروتين والحمض النووي الموضحة في الفيديو هو بروتين تفاعلي مناعيًا. وقد تم تطبيق جزء البروتين المعزول على شرائط اختبار التدفق الجانبي السريع للكشف عن e coli O 1 57.

تظهر عناصر التحكم تحديداً إيجابياً في جميع العينات التي تحمل e coli oh 1 5 7 مع أو بدون تحفيز shiga toin، كما يتضح من وجود نطاقين أحمرين. كما تُظهر البيانات نتائج إيجابية لتلك العينات التي تحمل e coli oh 1 5 7 والتي تمت معالجة الأحماض النووية والبروتينات فيها باستخدام ماصة الاستخلاص. وتوضح هذه البيانات أن البروتين المعزول من كل عينة نشط مناعياً، مما أدى إلى استجابة إيجابية.

يُعد البروتين المعزول مناسباً لعملية الفصل الكهربائي كما هو موضح هنا في هلام أكريلاميد 8% مصبوغ بصبغة كوماسي، ومحمل ببروتين BSA المعزول من إيزوثيوسيانات جودينا سداسي مولار. وباستخدام طريقة الاستخلاص والماصة والبروتوكول المصاحب، تبيّن أن الحركة الكهربائية للبروتين المعزول مطابقة لتلك الخاصة بعينات الضبط. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنك تنفيذها في أقل من 20 دقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية عزل البروتينات والأحماض النووية من الجهاز البسيط. شكرًا لتخصيص وقتك لمشاهدة الفيديو الخاص بنا.