مقايسة الوظيفية للفجوة صلي فحص. Electroporation للمن الخلايا الملتصقة على الإنديوم أكسيد القصدير

التثقيب الكهربائي هو تقنية يتم فيها تطبيق تيار كهربائي على خلايا حية من أجل فتح مسام مؤقتة في غشاء الخلية. ومن خلال هذه المسام، يمكن للأصباغ والجزيئات الأخرى التي لا تعبر غشاء الخلية في الحالة العادية أن تدخل إلى الخلية، ثم تغلق هذه المسام بسرعة دون إلحاق ضرر بالخلية. سنقوم بشرح كيفية إجراء التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة أثناء نموها على شريحة مغطاة جزئياً بمادة شفافة وموصلة للكهرباء.

المادة المستخدمة هي أكسيد indium tin oxide، ونظراً لقدرتها على توصيل التيار الكهربائي، فإنها تفتح مساماً تسمح للصبغة بالدخول إلى الخلية. ومن ثم يصبح من الممكن فحص ما إذا كانت الخلايا تحتوي على فجوات اتصالية أم لا، وعدد هذه الفجوات الاتصالية التي تمثل قنوات صغيرة تربط الأجزاء الداخلية للخلايا المتجاورة وتسمح بمرور الجزيئات الصغيرة. ومن المعروف منذ فترة طويلة أن التواصل عبر الفجوات الاتصالية يؤدي مجموعة متنوعة من الوظائف المهمة في الخلية، بما في ذلك التحول الورمي والانتقال السرطاني.

أهلاً بكم في هذا العرض التقديمي حول مشاريع الخلايا، والذي يتناول كيفية إجراء عملية التثقيب الكهربائي للخلايا الملتصقة باستخدام جهاز Insitu. تُظهر هذه الصورة، وهو ما سنتمكن من تحقيقه، إدخال صبغة فلورية صفراء في خلايا تنمو على زجاج شفاف وموصل. وصولاً إلى هذا الخط، حيث يسهل رؤية الخط تحت مجهر تباين الأطوار.

إليك النتيجة. يمكنك أن ترى أن الصبغة قد انتشرت عبر الوصلات الفجوية من الخلايا الموجودة على اليسار، والتي تم تحميلها بالصبغة عن طريق التثقيب الكهربائي، إلى الخلايا الموجودة على اليمين. مما أدى إلى هذا التدرج في تألق الخلايا.

يتم تحضيرها ثم نقلها إلى أنبوب في جهاز الطرد المركزي. من المهم جداً أن تكون الخلايا موزعة بشكل جيد أثناء نموها في الغرفة. لهذا السبب، يفضل إجراء عملية الطرد المركزي للخلايا لإزالة أي آثار للـ trypsin.

يتم سحب الوسط الذي يحتوي على آثار من التربسين، ثم يُعاد تعليق الخلايا في حوالي واحد ملي لتر من وسط النمو، وبعد ذلك تُوضع في الغرفة. تحتوي الماصة على معلق الخلايا؛ لذا يتم إزالة الغطاء عن الغرفة وسحب الخلايا بواسطة الماصة وإضافتها قطرة بقطرة إلى الغرفة لتسهيل عملية نقلها. تُوضع الغرفة في طبق بتري بقطر ستة سنتيمتر.

تُعاد الحجرة إلى الحاضنة لنمو الخلايا. ستنتشر الخلايا المزرعة بشكل جيد وتنمو حتى تلامس بعضها البعض وتُشكل وصلات فجوية. عندما تصبح الخلايا جاهزة لإجراء عملية الترحيل الكهربائي، يتم ضبط مولد النبضات الموضعي (insitu pulse generator) وفقاً للشروط المطلوبة.

يرجى الرجوع إلى الدليل للحصول على وصف لعملية الإعداد البسيطة. عند ضبط الجهد الكهربائي في جهاز insitu، سيضيء الضوء الأحمر في لوحة المفاتيح. أخرج زجاجتي DMEM الخاليتين من الكالسيوم والمدفأتین من الحمام المائي؛ إحداهما تحتوي على DMEM خالية من الكالسيوم ولكن مع مصل منقى بالديال، والأخرى تحتوي على DMEM.

في غياب الكالسيوم، قم بتجهيز الماصات وتحميل المحلول الأصفر في الماصة الآلية. بدلاً من التنهد، أخرج الخلايا من الحاضنة. قم بإزالة الوسط عن طريق قلبه في بيكر الغسيل في البداية.

ثم يتم تجفيفها برفق على منديل ورقي، وغسلها مرة واحدة باستخدام DMEM خالي من الكالسيوم؛ ولا تحاول إزالة كل كمية DMEM تماماً لأن الخلايا قد تجف. أضف Lucifer yellow بعناية فوق الحاجز (Barrier) بحيث لا تضطرب الخلايا، ولكن بسرعة كافية لضمان عدم جفاف الخلايا. استخدم 200 µL لكل نصف من الغرفة.

ضع الغطاء على حجرة التثبيت في الموقع (insitu chamber)، ثم قم بتحميلها في المنزلق. تأكد من استقرار ألسنة نهاية الحجرة في فتحات المنزلق عن طريق دفع المنزلق. أدخل الحجرة في حامل الحجرة.

اضغط على زر النبض (pulse) في لوحة مفاتيح مولد النبضات. سيومض مؤشر LED الموجود على مولد النبضات وعلى حامل الغرفة باللون الأحمر أثناء عملية التثقيب الكهربائي، ثم يومض باللون الأخضر للإشارة إلى اكتمال دورة البدء. اسحب المنزلق للخلف أسفل حامل الغرفة ثم قم بإزالة الغرفة.

قم بشفط معظم صبغة Lucifer yellow لإعادة استخدامها، مع الحرص على عدم تجفيف الخلايا. أضف وسط DMEM الخالي من الكالسيوم. ومع استخدام المصل الميُسر، يساعد المصل في إغلاق المسام لتعود الغرفة إلى الحاضنة لكي يتم انتقال Lucifer yellow عبر الفجوات التواصلية.

يجب أن يكون التوقيت متسقاً من تجربة إلى أخرى. المعيار هو ثلاث دقائق. صب الوسط في الكأس المخصص للنفايات.

أضف محلول التثبيت فورمالديهايد بتركيز 4% باستخدام معجون أو ماصة، وانتظر في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين على الأقل. صب الفورمالديهايد واشطف عدة مرات باستخدام PBS؛ حيث تكون الخلايا مثبتة على الزجاج، لذا فإن خطر انفصالها أثناء الغسيل ضئيل.

لكي يتمكن الباحث من رؤية الخلايا باستخدام تباين الأطوار، من المهم وضع شريحة غطاء فوق الحجرة. املأ الحجرة بمحلول PBS بحيث يتشكل سطح مقعر محدب. ضع شريحة الغطاء مع تجنب تكون فقاعات الهواء.

لا تقلق إذا فاض محلول PBS، فقط قم بامتصاص الكمية الزائدة من PBS باستخدام منديل ورقي. ستحتاج إلى مجهر فلوري مقلوب، ويفضل أن يكون مزوداً بتباين طوري ووحدة تصفية لـ Lucifer yellow. ابحث عن حافة المنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي تحت وضع التباين الطوري.

ستلاحظ وجود خطين تحت الخلايا الفلورية. حيث سيظهر نصف الشريحة بفلورة شديدة. والخط الأقرب إلى الخلايا المتوهجة هو حافة المنطقة التي تعرضت للتثقيب الكهربائي.

وأي فلورة تتجاوز ذلك تعود إلى انتقال صبغة Lucifer yellow عبر الموصلات الفجوية. فعلى سبيل المثال، تُظهر هذه الصورة لخلايا ظهارية خلايا خضعت للتثقيب الكهربائي على الجانب الأيسر من الصورة، حيث تنقل Lucifer yellow إلى الخلايا المجاورة غير المثقبة كهربائيًا، مما يؤدي إلى تكوين تدرج من الخلايا المتوهجة من حافة الطلاء الموصل باتجاه اليمين. وتُظهر هذه الصورة الإطار ذاته من الخلايا تحت تباين الطور.

لاحظ أنه يمكنك رؤية الخط X بوضوح شديد. يمكن إجراء قياس كمي لمقدار الانتقال عبر الموصلات الفجوية يدوياً من خلال العمل على الصور الفلورية وصور تباين الطور للخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي. وتُعتبر النجوم الموجودة على طول حافة المنطقة الموصلة خلايا مانحة.

تم إجراء عملية التثقيب الكهربائي لها، وامتصت بروتين luc باللون الأصفر. وهي تنقل luc الأصفر إلى الخلايا المجاورة جهة اليمين، والتي تقوم بدورها بنقله. ويستمر ذلك لمسافات أبعد بكميات متناقصة.

يمكن أن تؤدي نسبة النقاط إلى النجوم، وهي 41 إلى ثمانية في هذه الحالة، إلى استخراج قيمة لمقارنة مدى اتساع انتقال الوصلات الفجوية في هذه الحالة. تبلغ قيمة مؤشر الوصلات الفجوية 5.1. وبديلاً عن تحديد الخلايا وعدّها يدوياً، يمكن استخدام برنامج لتحليل الصور لقياس الكميات النسبية للتوهج على الجانب غير المختار من حدود خلية خضعت للتثقيب الكهربائي.

لا تمتلك هذه الخلايا روابط فجوية. هنا تظهر الحافة اليمنى للمنطقة التي خضعت للتثقيب الكهربائي. لاحظ عدم وجود تدرج في الفلورة، مما يشير إلى غياب الروابط الفجوية تحت مجهر تباين الأطوار.

يمكنك رؤية جميع الخلايا بوضوح. لاحظ أن الخط X مرئي بوضوح أيضاً في هذا المثال.

تم تحفيز جميع الخلايا في الحجرة باستخدام عامل نمو البشرة EGF، وبعد مرور 10 دقائق تم تثبيتها وفحصها للكشف عن phospho arc. لاحظ أن الخلايا المصبوغة على اليمين لم يتم تعريضها للتثقيب الكهربائي، بينما الخلايا على اليسار وصولاً إلى هذا الخط قد خضعت للتثقيب الكهربائي. تظهر الخلايا غير المثقبة كهربائياً تصبغاً بنياً باستخدام جسم مضاد لـ phospho irk والبيروكسيداز المناعي.

لا تظهر الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي أي صبغ، حيث قام الببتيد الفسفوري الذي تم إدخاله عبر التثقيب الكهربائي بحجب نطاق SSH two لبروتين grab two وتثبيط فسفرة irk لـ EGF. لاحظ المنطقة التي يبلغ طولها من ثلاث إلى أربع خلايا إلى يمين الخط، حيث لا تظهر الخلايا التي لم يتم تثقيبها كهربائياً أي صبغ. هذه هي الخلايا التي اكتسبت الببتيد الحاجب من جيرانها الذين خضعوا للتثقيب الكهربائي عبر الموصلات الفجوية.

هذا هو أقوى برهان ممكن على أن تثبيط الإشارة يجب أن يكون ناتجاً عن الببتيد ولا يمكن أن يكون أثراً جانبياً لعملية التثقيب الكهربائي. وبما أن هذه الخلايا لم تخضع للتثقيب الكهربائي، فإن هذا هو الإطار ذاته الذي ظهر تحت تباين الطور. لاحظ عدم وجود أي تغيير في المورفولوجيا بعد التثقيب الكهربائي.

يمكن قياس التواصل عبر الموصلات الفجوية بدقة كمية في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا المستزرعة. ويعد إدخال الببتيدات لتعطيل مسارات تأشير محددة نهجاً قوياً لتقييم أهمية التفاعلات البروتينية-البروتينية التي تم تحديدها باستخدام بروتينات منقاة في الخلايا الحية. ويمكن أن تكون هذه هي الخطوة الأولى والمهمة في تطوير الأدوية الببتيدية.