تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التركيز الفيروسي من خلال قياس كمية الجسيمات الفيروسية المعدية عن طريق عد اللويحات المنفصلة في المزرعة الخلوية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زرع الخلايا لتكوين طبقة أحادية متلاصقة لإصابتها بالعدوى. تتمثل الخطوة الثانية في إجراء تخفيفات تسلسلية للعينة الفيروسية المجهولة المراد قياس كميتها. بعد ذلك، يتم إصابة الطبقات الأحادية المتلاصقة باستخدام التخفيفات التسلسلية للمخزون الفيروسي، يليه وضع طبقة تغطية مثبِّتة. الخطوة النهائية هي تثبيت وصبغ اللويحات بعد فترة الحضانة المناسبة للفيروس المعني من أجل عد اللويحات المنفصلة. في نهاية المطاف، يمكن استخدام مقايسات اللويحات وتعديلها بطرق مختلفة لتحديد العيارات الفيروسية لعينة فيروسية مجهولة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التراكب شبه الصلب، في أن عملية التطبيق والإزالة أبسط بكثير في كل من التطبيقات عالية الإنتاجية والتطبيقات التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب الأمر تسخين الكواشف. وتمتد آثار هذه التقنية إلى أبحاث العديد من الفيروسات المحللة المختلفة، حيث يسمح استخدام التراكب السائل في تنسيق 96 بئراً بالمسح السريع للمركبات العلاجية الجديدة، مما قد يقلل بشكل كبير من الساعات الطويلة التي تُقضى في المختبر لإجراء مقايسات اللويحات التقليدية.

في اليوم السابق للمقايسة، يتم زرع الخلايا المناسبة للفيروس المعني من أجل تحقيق درجة تلاحم تتراوح بين 90 و100% في يوم العدوى. يمكن أيضاً تحضير المحاليل المخزنة في اليوم السابق للمقايسة. أولاً، يتم تحضير محلول تثبيت مكون من 10% formaldehyde في ماء مقطر عن طريق خلط 5.56 milliliters من formaldehyde المخزن بتركيز 36% مع 14.44 milliliters من الماء المقطر. ثم يتم تحضير صبغة البنفسج البلوري المكونة من 1% crystal violet في 20% ethanol مخففة بالماء المقطر. بعد ذلك، ومع العمل تحت ظروف معقمة، يتم تحضير أوساط تكوين اللويحات (plaque media) بتركيز 2x المناسبة لنوع الخلايا المستخدمة. يتم ترشيح المحلول عبر مرشح بمسامية 0.2 micron إذا كانت أي من الكواشف غير معقمة. ولتحضير الطبقة السائلة المستخدمة في مقايسة اللويحات، يتم إضافة 2.4 grams من Avicel إلى دورق يحتوي على 97.6 milliliters من الماء المقطر مع الخلط السريع باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. يخلط المحلول في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح لزجاً جداً بحيث لا يستطيع قضيب التحريك تدويره. عند هذه النقطة، يتم نقل الدورق إلى هزاز الدوارق ورجه بقوة لمدة 30 minutes لضمان التجانس التام. وأخيراً، يتم تعقيم المحلول بجهاز الأوتوكلاف عند 121 degrees Celsius وبضغط 14 PSI لمدة 30 minutes.

وعندما ينتهي البرنامج، تُخزن العينات محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. ولتحضير طبقة تغطية من الأغاروز، قم بتحضير محلول مخزون من الأغاروز بتركيز 0.6% في ماء مقطر، وامزجه باستخدام قضيب تقليب ثم قم بمعالجته بالأوتوكليف لإذابته في المحلول. أما بالنسبة لطبقة تغطية من كربوكسي ميثيل سيليلوز، فقم بتحضير محلول كربوكسي ميثيل سيليلوز بتركيز 2% في ماء مقطر واخلطه، ثم قم بمعالجته بالأوتوكليف كما سبق.

في اليوم التالي لعملية الزرع، استخدم مجهراً مقلوباً للتحقق من درجة الاندماج وحيوية الخلايا قبل البدء في المقايسة. تأكد من أن الخلايا تظهر شكلاً مورفولوجياً خلوياً قياسياً وبدرجة اندماج تصل إلى 90% تقريباً.

قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للعينات المعدية في أوساط نمو خلوية، مع تغيير عدد التخفيفات المطلوبة بناءً على العيار المتوقع للفيروس المعني. كما يجب تحضير عينة ضابطة غير مصابة لضمان حيوية الخلايا بشكل مستقل والمساعدة في تحديد اللويحات. قم بنقل العينة الضابطة غير المصابة والتخفيفات التسلسلية باستخدام الماصة إلى آبار الطبق، مع الحرص على تجنب تعطيل الطبقة أحادية الخلايا.

استخدم حجماً كافياً من اللقاح لتغطية الخلايا مع الحفاظ على أقل حجم ممكن لزيادة تلامس الفيروس مع الطبقة أحادية الخلايا. ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة واترك الخلايا لتصاب بالفيروس لمدة تتراوح من 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. قم بهز الأطباق بلطف كل 20 دقيقة لضمان التغطية المتساوية ولمنع جفاف الطبقة أحادية الخلايا.

أثناء عملية العدوى، قم بتحضير محلول التشغيل للطبقات الغطائية السائلة. اخلط وسط الآجارات الخاص بتكوين اللويحات (plaque media) وهو دافئ مع مخزون Avicel بدرجة حرارة الغرفة بتركيز 1.2 إلى 2.4% بنسبة واحد إلى واحد للحصول على محلول تشغيل من وسط Avicel الغطائي بتركيز 0.6 إلى 1.2%. أما بالنسبة للطبقات الغطائية من الآجاروز أو CMC، فاخلط وسط الآجارات الدافئ مع محلول مخزون من إما الآجاروز المسخن بتركيز 0.6% أو CMC بتركيز 2% بنسبة واحد إلى واحد. ثم ضع الخليط في حمام مائي عند درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لموازنة درجة الحرارة. تأكد من أن المحلول دافئ وليس ساخناً عند اللمس لمنع موت الخلايا وانخفاض عيارات الفيروسات. بعد العدوى، ضع الطبقات الغطائية فوق الطبقات أحادية الخلايا المصابة. وبعد إضافة الطبقة الغطائية، حضن الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide لمدة تتراوح من يومين إلى 14 يوماً حسب نوع الفيروس الذي يتم تحليله.

لتثبيت الخلايا باستخدام طبقة سائلة، قم بسكب أو سحب طبقة Avicel، ثم انقل محلول فورمالدهيد بتركيز 10% إلى الآبار وثبتها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ليلة كاملة. أما بالنسبة للأغاروز أو CMC، فأضف محلول الفورمالدهيد مباشرة إلى الطبقة لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، تخلص من الفورمالدهيد ثم قم بإزالة السدادات شبه الصلبة للأغاروز يدوياً باستخدام الملعقة المسطحة.

اشطف لوحات خلايا Avicel بالماء لإزالة ما تبقى من مثبت الطبقة الفوقية قبل البدء في عملية التصبيغ.

للتصبيغ، غطِّ الخلايا بكمية قليلة من محلول البنفسج البلوري (crystal violet) لمدة 15 دقيقة تقريبًا. قم بهز الأطباق إذا لزم الأمر لضمان التغطية المتساوية. اغسل صبغة البنفسج البلوري برفق باستخدام الماء. وبمجرد التثبيت والتصبيغ والتجفيف، يتم تخزين اللويحات (plaques) لفترة غير محددة للتحليلات المستقبلية. قم بعد اللويحات في كل بئر، مع استبعاد الآبار التي تحتوي على أقل من خمس لويحات أو أكثر من 100 لويحة. احسب المتوسط لأي مكررات تقنية لنفس التخفيف. دوّن ملاحظات حول حجم اللويحات وشكلها المورفولوجي. حدد عيار الفيروس (viral titer) للعينة المخزونة عن طريق حساب متوسط عدد اللويحات لتخفيف معين ومقلوب عامل التخفيف الكلي.

تظهر هذه الصورة مقارنات لطبقة التغطية لـ plaque لفيروس حمى الوادي المتصدع باستخدام أطباق ذات 12 بئراً. تم استزراع خلايا Veros بكثافة 2.5 × 10⁵ خلية في أطباق ذات 12 بئراً، وتم إصابتها باستخدام 200 µL من عينة MP 12 البادئة المخففة تسلسلياً. بعد الإصابة، تم وضع طبقات تغطية بحجم 1.5 mL من agarose بنسبة 0.3%، أو Avicel بنسبة 0.6%، أو CMC بنسبة 1% للمقارنة المباشرة بين طبقات التغطية. يوضح هذا المدرج التكراري نتائج تعداد الـ plaque والعيارات لجميع طبقات التغطية الثلاث. وهنا تظهر مقارنات لطبقة التغطية لـ plaque لفيروس VEEV باستخدام أطباق ذات 12 بئراً. تم استزراع خلايا Veros كما سبق، وأصيبت بحجم 200 µL باستخدام نفس العينة البادئة المخففة تسلسلياً من سلالة لقاح VEEV-TC 83، وبعد الإصابة، تم وضع طبقات تغطية بحجم 1.5 mL من agarose بنسبة 0.3%، أو Avicel بنسبة 0.6%، أو CMC بنسبة 1% كما سبق.

مرة أخرى، يوضح المدرج التكراري نتائج تعداد اللويحات والتعيير لجميع التراكيب الغطائية الثلاثة. تعرض هذه الصورة مثالاً على التراكيب الغطائية للويحات ذات الإنتاجية العالية. حيث تم إصابة طبق مكون من 96 بئراً من خلايا Veros بتركيز 3 × 10⁴ خلية لكل بئر، وذلك باستخدام 50 µL من اللقاح المستمد من نفس العينة الأولية المخففة تسلسلياً من فيروس حمى الوادي المتصدع MP 12، لمدة ساعة واحدة في أربع مكررات. وبالنسبة للتراكيب الغطائية، تم تجربة تركيزات نهائية من Avicel بنسبة 0.6% و1.2% لتحديد مدى جدوى وقابلية تكرار استخدام التراكيب الغطائية السائلة بطريقة عالية الإنتاجية. يوضح هذا المدرج التكراري العيارات التي تم تحديدها من كل تركيب غطائي.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن كل فيروس يختلف عن الآخر، وقد تكون هناك حاجة إلى إجراء تحسينات تشمل استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، أو فترات حضانة مختلفة، أو أوساط نمو مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء مقايسة اللويحات الأساسية باستخدام كل من الطبقات السائلة وشبه الصلبة.