النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الخلايا العصبية الحسية الشمية في الجسم الحي لتصور التشكل المحوري وتطوره. يتم تحقيق ذلك عن طريق ثقب الفلورو أربعة ديكستران المقترن أولا في الخلايا العصبية الحسية الشمية المفردة. الخطوة الثانية هي الانتظار لمدة 24 ساعة للسماح للصبغة بالانتشار في العمليات المحورية للخلايا العصبية الحسية.

بعد ذلك ، يتم تخدير الشرغوف ويتم الحصول على كومة صور ثلاثية الأبعاد للمصباح الشمي باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتونات. الخطوة الأخيرة هي فحص الخلايا العصبية المسماة بشكل متكرر في نفس بعد فترات زمنية محددة. في النهاية ، تسمح إعادة بناء التشكل الخلوي بتصور التغييرات في التشكل المحوري.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية نمو المحاور نحو المناطق المستهدفة في الدماغ الأمامي وكيف تتشكل نقاط الاشتباك العصبي. قبل التجربة. تأكد من أن إعداد التثقيب الكهربائي يتكون من مجهر استريو بمسافة عمل كبيرة ومجهز بإضاءة الفلورسنت ومجموعات مرشحات للصبغة.

تستخدم للتثقيب الكهربائي إما تثقيبا كهربائيا مخصصا أحادي الخلية أو مولد نبض مربع عام متصل براسم الذبذبات. قم بتوصيل مخرجات التثقيب الكهربائي بحامل ماصة وقطب كهربائي للحمام. تأكد من أن كل من حامل الماصة وقطب الحمام يحتويان على أسلاك فضية مطلية بطبقة رقيقة من كلوريد الفضة.

بعد ذلك، قم بتركيب حامل الماصة على مناور دقيق للسماح بتحديد المواقع بدقة. بعد ذلك ، قم بتصنيع الماصات الدقيقة للتثقيب الكهربائي باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية بو سيليكات بخيوط داخلية. اضبط معلمات الماصة القطبية الصغيرة لإنتاج ساق أطول وماصة صغيرة ذات فتحة طرف أصغر مع مقاومة عالية للماصة للتثقيب الكهربائي أحادي الخلية.

ثم قم بقياس مقاومة الماصة مباشرة باستخدام الخلية المفردة المخصصة المثقبة بالكهرباء. في هذا الإجراء ، قم بإذابة الفلورو أربعة ديكستران مقترن في جرس الضفدع بتركيز ثلاثة مللي مولار. قسم محلول المخزون هذا إلى حصص صغيرة وقم بتخزين محلول للاستخدام المستقبلي في الفريزر.

بعد ذلك ، قم بإعادة ملء الماصة الدقيقة بواحد إلى خمسة ميكرولتر من محلول ديكستران. قم بنفض الغبار بعناية على الماصة الدقيقة لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من طرف الماصة. ثم قم بتركيب الماصة الدقيقة في حامل الماصة.

تأكد من أن السلك الفضي الموجود داخل الماصة على اتصال بمحلول الصبغة. الآن ، ضع قطعة صغيرة من المناديل في طبق بتري وقم بتغطيتها بكمية صغيرة من الماء تحتوي على 0.02٪ trica. بعد ذلك ، قم بتخدير الشرغوف قبل التحول في الماء الذي يحتوي على 0.02٪ trica.

تأكد من التخدير المناسب عن طريق لمسه والتأكد من أنه لا يستجيب. ثم انقل الشرغوف بعناية إلى طبق بتري المغطى بالأنسجة. تأكد من ملامسة القطب الكهربائي للأنسجة المبللة، وضع طرف الماصة الدقيقة بالقرب من العضو الشمي للشرغوف باستخدام مناور دقيق.

بعد ذلك ، اخترق الجلد الذي يغطي العضو الشمي. باستخدام طرف الماصة ، قم بدفع الطرف بحذر إلى طبقة الخلايا العصبية الحسية الموجودة مركزيا في الظهارة الشمية الرئيسية أو ظهارة الأنف MRO. الآن قم بتشغيل نبضات الجهد المربع الموجب من أجل نقل الصبغة إلى الخلايا العصبية الحسية عن طريق تطبيق قطب جهد واحد أو قطارات من نبضات متعددة.

ثم تصور بثق الصبغة الناجح والتثقيب الكهربائي باستخدام مجهر ستيريو فلوري. تنتشر الصبغة بسرعة في جسم الخلية والتشعبات بعد التثقيب الكهربائي الناجح. بعد تكرار الإجراءات الخاصة بالعضو الشمي الثاني للشرغوف ، انقل الشرغوف إلى دورق مملوء بالماء العذب للتعافي ، واترك الصبغة المثقبة بالكهرباء تنتشر إلى الخلايا العصبية الحسية والبصلة الشمية.

بعد 24 ساعة على الأقل من التثقيب الكهربائي ، قم بتخدير الشرغوف في الماء الذي يحتوي على 0.02٪ trica. بعد ذلك ، انقل الشرغوف بعناية إلى غرفة التصوير. قطع مستطيل صغير من شريط من البارام.

ثم قم بتغطية الشرغوف بالبارام ، تاركا سيفالون الذيل الأمامي من خلال نافذة القطع. قم بإصلاح البارام بإبر على الطبق دون إصابة الشرغوف ، وتأكد من غمر الشرغوف في ماء كاف يحتوي على 0.02٪ تريكا. بعد ذلك قم بتركيب غرفة التصوير على مسرح مجهر متعدد الفوتون المستقيم أو المجهر متحد البؤر.

احصل على كومة ثلاثية الأبعاد من الصور للمصباح الشمي وتأكد من أن إجراء التصوير لا يتجاوز 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك ، أعد الشرغوف إلى الماء العادي في خزان منفصل ومنعه من التعرض للضوء. في هذه الصورة ، تم تزويد أربعة خيوط سطح بالكهرباء مقترنة بأربعة فلورو مختلفة في أربعة مواقع بعيدة من العضو الشمي ، يشار إليها بشكل جانبي باللون الأخضر ، ويشير إلى اللون المتوسط الأصفر المشار إليه باللون الأحمر ، والعضو الأنفي المشار إليه باللون البرتقالي.

هذا يسمح بتصور المصباح الشمي الملحق ومجالات الإسقاط الرئيسية الثلاثة للمصباح الشمي الرئيسي. تظهر هذه الصورة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لأنماط النمو المحورية المختلفة للخلايا العصبية الحسية الشمية المفردة المتراكبة على بنية البصلة الشمية ، وهنا مثال على محور عصبي حسي شمي واحد يسقط في البصلة الشمية ويشكل الشجرة المعنقدة في الكبيبات الكروية. كما هو موضح هنا في Opus Levu ، تتشعب هذه المحاور بانتظام قبل الاتصال بواحد أو اثنين أو عدة محاور.

هذا مثال تمثيلي للخلايا العصبية الحسية الشمية الفردية التي تم فحصها مرارا وتكرارا عن طريق التصوير بفاصل زمني في الجسم الحي يظهر تغيرات مستمرة في التشكل المحوري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الخلايا العصبية الحسية الشمية عن طريق التثقيب الكهربائي وكيفية مراقبة تطورها باستخدام التصوير في الجسم الحي