رباعية المناعية من لمبة الشمية لتصور رموز حسية أكسون الجزيئية الحسية

الهدف العام من طريقة التلوين الكيميائي المناعي هذا هو تصور التعبير المشترك لجزيئات فرز المحاور العصبي في الطرف المحوري للخلايا العصبية الحسية الشمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توصيف العمليات الرئيسية في مجال التطور الشمي ، مثل توجيه المحاور العصبية ، وتكوينات المشبك ، وتجديد الخلايا العصبية الحسية الشمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للعلماء بمقارنة وتحليل أنماط التعبير عن جزيئات فرز المحاور العصبي في البصلة الشمية دون الحفاظ على التباين بين الأقسام.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوة التضمين ، لأنه يصعب وصف موضع وزاوية عينة الأنسجة الشمية في القالب بالكلمات. ابدأ برؤوس الفئران التي تتراوح أعمارها بين أسبوعين وأسبوعين والتي تم إصلاحها عن طريق التروية داخل القلب بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. أدخل شفرة مقص في الفراغ بين الأسنان العلوية والسفلية ، واقطعها أفقيا لإزالة عظم الفك السفلي.

ثم قم بقص الأنسجة الزائدة بالملقط والمقص ، لترك الأنسجة الشمية ، بما في ذلك البصلة الشمية والظهارة الشمية. اغمر الأنسجة الشمية في PBS لإزالة الهواء في تجويف الأنف ، ثم قم بعمل قطع رأسي لإزالة الجزء الخلفي من الدماغ ، ووضع الأنسجة الشمية في الجزء السفلي من قالب التضمين مع توجيه الطرف المقطوع لأسفل. املأ القالب بمركب درجة حرارة القطع الأمثل ، ثم اغمره في النيتروجين السائل.

بعد تجميد الأنسجة و OCT تماما ، قم بموازنة الأنسجة في ناظم البرد عند 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. الآن قم بعمل أقسام متسلسلة من البصلة الشمية باستخدام ناظم التبريد ، واجمعها عن طريق الالتصاق بشرائح الزجاج المطلية ب MAS. بعد الالتصاق ، جفف الشرائح على الفور باستخدام مجفف الشعر.

ابدأ في التلوين المناعي عن طريق غسل الشرائح المجففة باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بحظر مواقع الربط غير المحددة عن طريق احتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة بمحلول حجب بنسبة 5٪ في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 400 ميكرولتر من مزيج من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول مانع بنسبة 1٪ لكل شريحة.

احتضن الشرائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، تخلص من محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشرائح باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 400 ميكرولتر من مزيج من الأجسام المضادة الثانوية و PBS إلى كل شريحة.

يحفظ من الضوء ويحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، تخلص من المحلول واغسل الشرائح مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، ينزلق غطاء التثبيت على الشرائح عن طريق وضع قطرتين من وسيط التثبيت على كل شريحة ، ووضع زلة الغطاء ، وإزالة فقاعات الهواء.

احصل على صور الفلورسنت باستخدام المجهر الفلوري باستخدام المرشح المناسب لكل فلوروفور. اضبط وقت التعرض للحصول على إشارات الفلورسنت للصورة دون تشبع. تحديد التركيب الكبيبي عن طريق إشارات الفلورسنت المناعي ل GLUT2.

استخدم الصورة J لقياس شدة تلطيخ جزيئات الفرز العصبي داخل الكبيبات. تظهر هذه الصورة قسما من البصلة الشمية المجاورة لمعوم من فأر عمره أسبوعان ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة ضد VGLUT2 ، و Kirrel2 موضح باللون الأحمر ، و Semaphorin 7A موضح باللون الأخضر ، و OLPC باللون الأزرق. توضح الصورة المدمجة أن جزيئات الفرز العصبي المشاركة في الفصل الكبيبي يتم التعبير عنها في نمط فسيفساء مستقل عن الموضع.

يتم تعريف كل كبيبة من خلال إشارات الفلورسنت لعلامة ما قبل المشبكي VGLUT2. الهياكل الكبيبية محاطة بخطوط متقطعة. تم قياس شدة إشارة جزيئات الفرز المحوري في كل كبيبة.

كما هو موضح هنا ، يتم التعبير عن جزيئات الفرز المحوري بشكل تفاضلي في كل كبيبة. على سبيل المثال ، يحتوي الكبيبة 3 على مستويات عالية من OLPC ، ومستويات متوسطة من Semaphorin 7A ، ومستويات أقل من Kirrel2 ، ويمكن قياس هذا الاختلاف عن طريق قياس شدة التلوين. في حين أن الكبيبات 4 تحتوي على مستويات عالية من OLPC ، ومستويات أقل من Kirrel2 و Semaphorin 7A.

مرة أخرى ، يمكن قياس هذا الاختلاف عن طريق قياس شدة التلوين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حذف التثبيت اللاحق باستخدام PFA ، والعلاج بمحلول السكروز ، والذي يوصى به عادة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وضع المزيد من الكبيبات على قسم البصلة الشمية المفردة ، وكيفية إجراء تلطيخ مناعي عالي الجودة باستخدام أجسام مضادة متعددة ، والتي يمكن تطبيقها على مناطق الدماغ الأخرى.

لا تنس أن تأمل أن تساعدك هذه الطريقة على النجاح في تجاربك المستقبلية.