ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

الهدف من هذا الإجراء هو زراعة وتشغيل الفأر الجنيني ، قوقعة الهواء exvivo. من أجل دراسة الجوانب المختلفة لتطور القوقعة ، بما في ذلك تمايز التشكل وأحداث النمو ، يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على الرأس من جنين الفأر الجنيني 13 في اليوم. بعد ذلك ، قم بتعريض الأذنين الداخلية عن طريق إزالة الدماغ وعزلها عن العظم الصدغي النامي عن طريق الانفصال عن قاعدة الجمجمة.

ثم قم بإزالة الغضروف المغطى وافتح قناة القوقعة الصناعية للحصول على الظهارة الحسية للقوقعة. الخطوة الأخيرة هي زراعة القوقعة الصناعية المقطعة مع أو بدون التثقيب الكهربائي لمدة تصل إلى أسبوع واحد. في النهاية ، يمكن تحليل الغرسات لتصوير الخلايا الحية أو صبغة مناعية ثابتة وتحليلها عن طريق التصوير متحد البؤر ، زراعة الفأر الجنينية.

يوفر Explan Cochlear نظاما ممتازا لدراسة الجوانب المختلفة لتكوين الأعضاء ، مثل التكاثر ومواصفات الكبريتات والقطبية في القوقعة النامية وكيف تساهم هذه الأحداث في النمو والتمايز. لذلك تسمح هذه التقنية للمرء بإجراء التلاعب الدوائي ومراقبة وظائف الجينات خارج الجسم الحي. وهكذا ، فإن هذه التقنية إلى جانب نقل الجينات عن طريق التثقيب الكهربائي ، يمكن للمرء أن يغير التعبير عن الجين محل الاهتمام ويراقب وظيفته على مستوى خلية واحدة.

لبدء هذا الإجراء ، ضع رأس جنين فأر E 13 في طبق سوغار معقم يحتوي على محلول تشريح بارد. تحت مجهر تشريح ، قم بتثبيت رأس الجنين عن طريق وضع دبابيس دقيقة حول منطقة العين. ثم باستخدام زوجين من الملقط المعقم ، قم بإزالة الجلد بعناية وافتح الجمجمة على الجانب الظهري على طول خط الوسط.

بعد ذلك ، قم بإزالة الدماغ من تجويف الجمجمة. يمكن التعرف على الأذنين الداخلية الموجودة داخل العظام الصدغية من بطانة الأوعية الدموية المحيطة بها. بعد ذلك ، قم بتشريح الأذنين الداخليتين من العظام الصدغية عن طريق وضع الملقط تحت الأنسجة وعزل الأذن الداخلية عن قاعدة الجمجمة.

بعد ذلك ، انقل الأذنين الداخلية المقطعة إلى طبق جديد يحتوي على محلول تشريح بارد. الآن قم بتوجيه الأذن الداخلية بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى. قم بتثبيت الأذن الداخلية عن طريق إدخال الطرف الحاد من دبابيس المينوشين برفق من خلال الجزء الدهليزي.

باستخدام ملقط فائق النعومة ، افتح الغضروف المغطى عن طريق عمل شق بالقرب من النافذة البيضاوية. تأكد من عدم إدخال الملقط بعمق شديد في الغضروف حيث يتم أحيانا دمج الغضروف العلوي مع قناة القوقعة الصناعية. ثم قم بإزالة الغضروف بعناية من القوقعة.

بعد ذلك ، قم بكشف الظهارة الحسية عن طريق وضع الملقط في القاعدة أو في قمة قناة القوقعة الصناعية واسحب سقف القوقعة برفق للخارج. كخطوة أخيرة ، قم بإزالة النسيج الضام الأساسي بعناية من الظهارة الحسية المكشوفة بحيث تكون قاعدة مخطط القوقعة الصناعية مسطحة. بعد ذلك ، قم بعزل القوقعة المقطعة عن الجزء الدهليزي من الأذن الداخلية.

انقل الظهارة الحسية للقوقعة الصناعية المشرحة إلى مصفوفة الغشاء القاعدي المزرعة المطلية جيدا باستخدام مغرفة معقمة مقاس 1.5 ملم إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التنظيف لإزالة الأنسجة الزائدة ، يمكن إجراء ذلك خلال هذه المرحلة. ثم قم بتوجيه مخطط القوقعة الصناعية بحيث يكون السطح اللموعي للظهارة متجها لأعلى. قم بشفط محلول مصفوفة الغشاء القاعدي DMEM لتسطيح الأنسجة بعناية وإضافة 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج برفق إلى الطبق.

تأكد من أن كل x explan a يلتصق جيدا بزلة الغطاء الزجاجي المطلي ولا يطفو في وسط الاستزراع. بعد ذلك ، انقل القوقعة الصناعية الدقيقة التشريح برفق إلى طبق مزرعة معقم 150 ملم وضعه في حاضنة زراعة الأنسجة. أ 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لثلاثة إلى ستة DIV.

بعد 1D IV.افحص المزرعة تحت مجهر تشريح للتأكد من أن مخطط القوقعة الصناعي يلتصق جيدا بطبق الثقافة. ثم استمر في احتضان الثقافة في الجسم الحي للفترة الزمنية المطلوبة قبل معالجتها للكيمياء النسيجية المناعية لإعدادها للتثقيب الكهربائي. قم أولا بتعقيم طبق زجاجي مطلي بالسيجار مقاس 100 ملم عن طريق التعقيم أو النقع في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة تقريبا.

ثم اتركه يجف في الهواء على مقعد نظيف قبل الاستخدام. الآن قم بإعداد الحمض النووي من ناقل التعبير المفضل باستخدام مجموعة إعداد maxi أو MIDI مناسبة. متجهات التعبير المستخدمة في هذا البروتوكول هي بناء تعبير H واحد وبناء تعبير واحد للعصبية D.

ويجب أن يكون التركيز النهائي للحمض النووي ميكروغراما واحدا على الأقل لكل ميكرولتر في الحمض النووي الريبي المعقم ، والماء الحر للحمض النووي الريبي لتشغيل الحمض النووي الكهربائي في مخطط القوقعة الصناعية. أضف 10 ميكرولترات من محلول الحمض النووي في البلازما إلى طبق طازج مغطى بالسيجار 100 ملم. ثم انقل مخطط القوقعة الصناعية التشريح بالكامل إلى محلول الحمض النووي بحيث يكون السطح اللمعي للظهارة متجها لأعلى.

قم بإمالة القوقعة قليلا بحيث تكون عمودية على مستوى الطبق. بعد ذلك ، ضع مجداف القطب السالب باتجاه الظهارة الحسية ومجداف القطب الموجب بجوار قاعدة القوقعة الصناعية باستخدام الماتور الكهربائي. قم بتوصيل تسعة إلى 10 نبضات من 24 مللي فولت مدة نبضة 30 مللي ثانية.

أضف بعد ذلك 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ إلى القوقعة الصناعية المصنفة كهربائيا. كرر الإجراءات الخاصة بجميع مخططات القوقعة الصناعية والحمض النووي لجميع الجينات ذات الأهمية قبل نقل القوقعة المصنفة كهربائيا إلى الطبق المطلي بمصفوفة الغشاء القاعدي للطلاء. ثم استزراع كل القوقعة المصنفة كهربائيا في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ للفترة الزمنية المرغوبة ، والتي ستتم معالجتها بعد ذلك لكيمياء السيتو المناعية.

تظهر هذه الصور اليوم الجنيني 13 غرسات القوقعة الصناعية من النوع البري CD واحد حانات الفأر ، والتي يتم تكوينها بالكهرباء باستخدام TH واحد أو EEG FP أو عصبية D واحدة يبنى مراسل EGFP. تم تصنيفها مناعية بعلامة خاصة بخلية الشعر ، أو مضاد myo seven A أو علامة عصبية اثنين إلى واحد باللون الأحمر. تظهر الخلايا المصنفة كهربائيا ، والتي يمكن تصورها عن طريق تعبير EGFP في جميع أنحاء التلال الظهارية الأكبر ، والتلال الظهارية الأصغر وخلايا الظهارة الحسية.

قام الجهاز العصبي D واحد بنقل الخلايا الظهارية القوقعية بعد خمسة DIV اكتسبت النمط الظاهري العصبي مع عمليات شجيرية ، كان معظمها إيجابيا لاثنين أو T oh H واحد. كانت الخلايا المنقولة إيجابية ل myo seven. تعبير بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات لتر إنتل من ثمانية إلى 10 ملوثات ثابتة.

سيتيح ذلك متسعا من الوقت لثقافة التشريح ، والتثقيب الكهربائي ، وطلاء التخطيط.