الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح كيفية تمييز الروابط المشبكية بين الخلايا العصبية المحددة شكليا من الناحيتين الوظيفية والهيكلية. يتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على شرائح دماغية حادة ، والتي تم تحسينها لدراسة اتصال متشابك معين. ثم يتم استخدام لقط التصحيح لاختبار الخلايا العصبية المقترنة متشابك.

لهذا الغرض ، يتم تصحيح خلية عصبية فردية محتملة بعد التشابك ، ثم يتم استخدام ماصة ثانية لتحفيز الخلايا العصبية المحيطة من أجل إثبات وجود اتصال متشابك. إذا لم تظهر أي استجابة ، يتم تحريك القطب المحفز. بمجرد العثور على اتصال ، يتم إعادة مطابقة الخلايا العصبية قبل المشبكية في وضع البيع بالجملة.

بعد التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية من هذه الخلايا العصبية وحشوات البيوتين المتزامنة ، يتم إصلاح الشريحة ومعالجتها من أجل البيوتين ويتم إجراء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر للخلايا العصبية. في النهاية ، تهدف طريقتنا إلى تحليل كمي هيكلي ووظيفي مرتبط للدوائر الدقيقة العصبية. الميزة الرئيسية للتسجيلات المزدوجة من الخلايا العصبية المقترنة متشابكيا هي أنه يمكننا إجراء تحليل هيكلي ووظيفي مرتبط لكل من الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي في الدوائر العصبية الدقيقة.

حتى في الآونة الأخيرة ، التقنيات التي تم إدخالها مثل التحفيز البصري للخلايا العصبية غير قادرة حتى الآن على تحقيق ذلك بنفس القدر من التفاصيل. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الإثارة والتثبيط لأنواع الخلايا العصبية المحددة شكليا وكيفية تعديل النشاط. وتوضيح إجراءات تسجيلات الأليفة سيكون قوان.

هو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. بعد تحضير شرائح من المنطقة المستهدفة ، اسمح لها بالحضانة خلال هذا الوقت ، واسحب ماصات التصحيح ، والتي يجب أن يكون لها ساق طويلة ونحيلة. بعد تأمين شريحة دماغية بقيثارة بلاتينية في غرفة تجريبية ، املأ ماصة التسجيل بمحلول داخلي.

ضع الماصة في مكبر الصوت المسبق وقم بتصحيح خلية عصبية مفترضة بعد التشابك في وضع الخلية بأكملها باستخدام ماصة رقعة بحث من ثمانية إلى 10 ميجا أوم مقاومة مملوءة بمحلول داخلي يتم فيه استبدال أملاح البوتاسيوم بأملاح الصوديوم. ضع شفطا لطيفا على الماصة الباحثة لتصحيح خلية عصبية محتملة قبل المشبكي في خلية فضفاضة. التكوين المرفق.

امسك إمكانات الغشاء تحت الختم السائب بين سالب 30 سالب 60 مللي فولت في وضع المشبك الحالي. ثم قم بتطبيق نبضات تيار كبيرة من 0.2 إلى اثنين من النانو أمبير لاستنباط جهد فعل في الخلية قبل المشبكي المحتملة. لاحظ إمكانات الفعل هذه كسنيبلات صغيرة على استجابة الجهد.

اضبط تردد التحفيز على 0.1 هرتز لمنع انخفاض استجابة ما بعد المشبكي. إذا لم تستجب الخلايا العصبية بعد المشبكي لتحفيز رقعة الخلايا العصبية قبل المشبكية التي يحتمل أن تكون مختبرة ، فإن خلية عصبية محتملة جديدة قبل المشبكي في وضع الختم الفضفاض. اختبر ما يصل إلى 30 خلية عصبية قبل المشبكية بهذه الطريقة.

الاستمرار في استخدام نفس قطب تصحيح البحث طالما يمكن إنشاء ختم بمقاومة أكبر من 30 ميجا أوم. إذا أدى التحفيز في وضع الختم السائب إلى EPSP أو IPSP بزمن انتقال أقل من خمسة مللي ثانية في الخلايا العصبية بعد المشبكي ، فقم بإزالة ماصة البحث من الخلايا العصبية قبل المشبكية باستخدام قطب رقعة تسجيل مملوء بمحلول داخلي منتظم يحتوي على محلول داخلي منتظم بمقاومة من أربعة إلى ثمانية ميجا أوم. قم بتصحيح الخلايا العصبية قبل المشبكية وسجلها في وضع المشبك الحالي للخلية بأكملها.

استنباط إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي في الخلايا العصبية قبل المشبكية وتسجيل استجابة ما بعد المشبكي. قم بتخزين البيانات على جهاز كمبيوتر لتحليلها لاحقا دون اتصال. طوال التسجيل ، ينتشر البيوتين في الخلايا العصبية للحصول على تلطيخ مناسب.

اسمح للبيوتين بالانتشار لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الأقل حسب حجم الخلايا العصبية. بالنسبة للدوائر الدقيقة العصبية ذات نسبة الاتصال العالية ، لا يتم استخدام قطب بحث. بدلا من ذلك ، ابدأ بترقيع خلية عصبية قبل المشبكية مباشرة في وضع الخلية بأكملها.

ثم باستخدام قطب كهربائي مليء بمحلول داخلي منتظم ، خلية عصبية محتملة بعد المشبكي أيضا في وضع الخلية بأكملها ، يجب أن تكون كلتا الخليتين تحت سيطرة المشبك الحالي. استنباط جهد فعل في الخلية قبل المشبكية ومراقبة الخلايا العصبية المحتملة بعد المشبكي للحصول على إمكانات ما بعد المشبكي. إذا لم تظهر الخلايا العصبية استجابة للتحفيز قبل المشبكي ، فاستخدم قطبا كهربائيا جديدا لتصحيح خلية عصبية جديدة مرة أخرى في وضع الخلية بأكملها.

عند العثور على توصيل، تابع التسجيل كما هو موضح سابقا دون تغيير ماصة التصحيح. بعد تثبيت الشرائح وتركيبها كما هو موضح في بروتوكول النص ، افحص الخلايا العصبية المسماة بالبيوتين تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن الهراوات المحورية والعمود الفقري الشجيري مرئية بوضوح.

باستخدام نظام تتبع الخلايا العصبية التجارية ، تتبع الخلايا العصبية يدويا أو أزواج الخلايا العصبية المقترنة متشابكة. تأكد من تضمين حتى الضمانات المحورية أو الشجيرية الصغيرة. استخدم الآثار للحصول على إعادة بناء الخلايا العصبية ثلاثية الأبعاد ، وتصحيح إعادة بناء الخلايا العصبية للانكماش في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة في القسم المناسب من برنامج التتبع.

عوامل تصحيح الانكماش لوسط التضمين هي حوالي 1.1 للاتجاهين x و y ، وحوالي 2.1 للاتجاه Z. زوج خلية مقترن بشكل متبادل يتكون من نجمة شوكية وارتفاع سريع في الخلايا العصبية. في الطبقة القشرية الرابعة كانت مليئة بالبيوتين.

أثناء التسجيل ، تشير النقاط الخضراء إلى اتصالات متشابكة مثيرة مفترضة بين الخلايا العصبية الشوكية قبل التشابك والخلايا العصبية بين ما بعد التشابك. تشير النقاط الزرقاء إلى جهات اتصال متشابكة مثبطة متبادلة مفترضة. يتم عرض صور عالية الطاقة لجهات الاتصال المشبكية هنا.

تظهر الدوائر الخضراء المفتوحة جهات اتصال مثيرة وتظهر الدوائر الزرقاء المفتوحة جهات اتصال مثبطة. يظهر هنا إعادة بناء العصبية الواضحة لهذا الزوج الخلوي المتصل بالتبادل. يظهر محور الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية باللون الأزرق ويظهر سوما وتغصناته باللون الأحمر.

محور الخلايا العصبية الشوكي باللون الأخضر وسوما ودايت باللون الأبيض. يظهر الجزء الداخلي المقصورات المتغصنة السوماتية للخلايا العصبية قبل وبعد التشابك. جنبا إلى جنب مع جهات الاتصال المشبكية المفترضة ، تم تحديد ملامح البرميل في الصور المجهرية منخفضة الطاقة للمجال الساطع المصنوعة من شريحة الدماغ الحادة.

هنا اتصال متشابك تمثيلي بنسبة اتصال منخفضة جدا. أثار جهد الفعل قبل المشبكي في خلية شبه معدنية من الطبقة السادسة إمكانات ما بعد المشبكي المثيرة أحادية المشبكية في طبقة من الخلايا العصبية البارافلزات ذات الأربع نجوم. زمن الوصول الموضح هنا لأكثر من ثلاثة مللي ثانية من هذا الاتصال الصفحي العابر أطول بكثير من زمن انتقال مللي ثانية تقريبا الذي لوحظ في الاتصالات المحلية داخل الصفيحة.

أثارت إمكانات عمل عند 10 هرتز في الطبقة السادسة من الخلايا شبه المعدنية إمكانات ما بعد التشابك في طبقة الخلايا العصبية الصغرى من النجوم الأربعة الموضحة هنا. لاحظ التيسير قصير الأجل. من المهم أن تتذكر أن حالة القطع تحتاج إلى تحسين لاتصال متشابك معين ، وأنه أثناء التسجيل ، يجب أن يكون الإعداد مستقرا تماما ومن ثم يتم ضمان الفهم الأمثل للتسجيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام القياسات الفيزيولوجية الكهربية وإعادة البناء المورفولوجية للحصول على صورة شاملة للخصائص الهيكلية والوظيفية للدوائر العصبية الدقيقة في القشرة المخية الحديثة.