تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

الهدف العام لهذه التقنية هو استخدام رؤية الكمبيوتر للكشف التلقائي عن الخلايا الفلورية وإجراء مشبك التصحيح الآلي لهذه الخلايا في شرائح الدماغ الحادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التغلب على الصعوبات الرئيسية في مجال الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح ، مثل تحديد الخلايا ذات العلامات الفلورية واستهدافها ومشبك التصحيح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكتشف تلقائيا ماصات التصحيح وخلايا الفلورسنت ودمج الخطوات مع مشبك التصحيح التلقائي.

يزيد هذا الابتكار بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص الاضطرابات العصبية ، لأنه يمكن استخدام مشبك التصحيح الأوتوماتيكي الموجه بالصور عالي الإنتاجية للفحوصات الدوائية في المزيد من المستحضرات العصبية الفسيولوجية. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على المستحضرات الأخرى في المختبر ، مثل الثقافات العصبية العضية العصبية ، أو الثقافات الشرائحية ، وفصل الخلايا العصبية وكذلك أي خلايا غير عصبية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتشغيل مكبر الصوت ووحدة التحكم في المجهر ووحدة التحكم في المناويل. بعد ذلك، قم بتشغيل Autopatcher IG مع python من محطة سطر الأوامر عن طريق تغيير الدليل حيث تم تثبيت Autopatcher IG أولا. بعد ذلك ، اكتب Python Autopatcher_IG.

PYW في محطة سطر الأوامر واضغط على مفتاح الإدخال. بعد ذلك ، املأ كل الماصة الزجاجية بمحلول داخلي وقم بتحميلها على مرحلة الرأس. حرك طرف الماصة إلى المجال البصري للمجهر وجعله في بؤرة التركيز.

إذا تم استخدام لوحة الاتصال لتحريك المتلاعبين في مرحلة المجهر، فقم بتحديث الإحداثيات بالضغط على Z على لوحة المفاتيح. تقوم المعايرة الأولية بتحويل زاوية ومسافة الحركة بواسطة المناور إلى نظام إحداثيات المجهر. يتحرك المناور في ثلاثة اتجاهات بمسافة محددة مسبقا ويكتشف البرنامج إحداثيات طرف الماصة داخل المجال البصري للمجهر.

انقر فوق زر بدء المعايرة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية للوحدة المقابلة التي يتم تحميل الماصة عليها. بعد ذلك ، احفظ المعايرة بالنقر فوق حفظ المعايرة في الجزء السفلي من واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. هذه المعايرة الأولية ضرورية فقط لإجراء مرة واحدة ما لم يتم تغيير التنظيم المادي للجهاز.

في هذه الخطوة ، ضع شريحة دماغ واحدة في وسط غرفة التسجيل. قم بتثبيت شريحة الدماغ بشريحة باستمرار أو قيثارة. للكشف عن الخلية الفلورية ، أوجد منطقة الاهتمام تحت التكبير أربع مرات.

بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر عن طريق تشغيل وضع النقر للنقل والنقر فوق مركز منطقة الاهتمام. بدلا من ذلك ، استخدم لوحة المفاتيح لتحريك مرحلة المجهر. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى عدسة التكبير العالية واضبط التركيز عن طريق تحريك المجهر في المحور Z باستخدام التردد اللاسلكي على لوحة المفاتيح.

يوجه البرنامج المجهر والكاميرا لالتقاط سلسلة من الصور على أعماق مختلفة. بعد ذلك ، تخضع هذه الصور لمعالجة رؤية الكمبيوتر للعثور على خلايا ذات علامات فلورسنت. الإخراج النهائي هو قائمة بإحداثيات الخلايا المكتشفة.

انقر فوق زر الكشف عن الخلية في وحدة عمود واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية صفر. إذا تعذر التحكم في مصدر ضوء LED أو الليزر للإعداد بواسطة إشارة TTL ، فقم بتشغيل مؤشر LED أو الليزر يدويا. قم بإيقاف تشغيل LED أو الليزر إذا لزم الأمر.

ستظهر قائمة بإحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لمواضع الذاكرة. قم بإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من القائمة بالنقر فوق الزر X بجوار الإحداثيات. بدلا من ذلك، إذا لم يتم تسمية الخلايا المستهدفة بالفلورسنت، فانقر فوق وضع الماوس على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية.

ثم انقر فوق الخلية محل الاهتمام ، وستظهر نقطة صفراء برقم على الخلية وستظهر إحداثيات الخلية في مواضع الذاكرة واجهة المستخدم الرسومية. لإجراء المعايرة الثانوية للكشف عن إحداثيات إزاحة الماصة، املأ 1/3 من الماصة الزجاجية بمحلول داخلي. بعد ذلك، قم بتحميل الماصة على حامل الماصة المتصل بمرحلة الرأس.

عند التكبير المنخفض، استخدم واحدا واثنين على لوحة المفاتيح للتبديل بين الوحدة الأولى والوحدة الثانية. بعد ذلك ، أحضر الماصة إلى المجال المرئي واضبط التركيز باستخدام لوحة المفاتيح. بعد ذلك ، قم بتحميل المعايرة الأساسية بالنقر فوق معايرة الحمل.

قم بتبديل عدسة المجهر إلى التكبير العالي وانقر 40 مرة على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. أحضر طرف الماصة إلى المنتصف. ثم انقر فوق زر المعايرة الثانوية على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية، أسفل الوحدة المستخدمة.

لتصحيح خلية مستهدفة ، انقر فوق زر التحكم في التصحيح لفتح واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. انقر فوق الزر الانتقال إلى بجوار الخلية محل الاهتمام في قائمة الإحداثيات في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لموضع الذاكرة. بعد ذلك ، انقر فوق الزر CTM للوحدة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية لتمكين الحركة.

انقر فوق الخلية محل الاهتمام لنقل طرف الماصة إلى الخلية. نظرا للقيود الميكانيكية للمناور ، عند السفر لمسافة أطول من 500 ميكرومتر ، قد يكون هناك خطأ طفيف في تحديد المواقع. لمنع حدوث خطأ كبير في تحديد المواقع الميكانيكية ، يجب إجراء المعايرة الثانوية بالقرب من الخلية المستهدفة.

بعد ذلك ، استخدم الوحدة زر واحد محدد لتبديل إشارة الإدخال بين الوحدتين. انقر فوق زر التصحيح في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. سيبدأ الترقيع التلقائي ويمكن مراقبة الضغط والمقاومة على واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح.

تراقب خوارزمية التصحيح الأوتوماتيكية المقاومة وتتحكم في الضغط من خلال سلسلة من الحلقات المنطقية ، لتشكيل جيجاسيل. تخطر النافذة المنبثقة بتكوين gigaseal. يستخدم النظام تغيير المقاومة للتعرف على ملامسة سطح الخلية.

في حالة عدم اكتشاف ملامسة سطح الخلية في الوقت المناسب ، استخدم الزر التالي للتقدم في مرحلة الترقيع مع البقاء في نفس تجربة الترقيع التلقائية. قم بمعالجة العملية التلقائية في أي وقت من خلال النقر على الأزرار المعنية في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. ثم حدد نعم للاقتحام مع Zap والشفط المدمجين.

بدلا من ذلك ، حدد لا للاقتحام بالشفط فقط. ثم احفظ سجل تصحيح التجربة. يوضح هذا الشكل المواقع المحددة التي تم تحميلها إلى واجهة المستخدم الرسومية لتسلسل الأوامر.

يعرض العمود الأيسر قائمة الإحداثيات ويعرض العمود الأيمن قائمة الأوامر في شكل إشارات TTL لكل موقع. فيما يلي لقطات الشاشة أثناء تجربة تطبيق الدواء ، المقابلة للمواقع الثلاثة المحددة. تم خلط محلول KCL مع صبغة الفلورسنت الحمراء لغرض التصور.

كانت الوحدة الأولى عبارة عن الماصة المحتوية على KCL والوحدة الثانية كانت ماصة الترقيع. في هذا الشكل ، تظهر الحقن الحالية للخطوة خلية عصبية متصاعدة منتظمة. تظهر هنا آثار تسجيل مشبك الجهد من التطبيق المحلي لمحلول كلوريد البوتاسيوم 500 مللي مولار في ثلاثة مواقع.

تم تسجيل الأثر الأحمر مع التيار الداخلي من التجربة عندما كان تطبيق كلوريد البوتاسيوم قريبا من خلية التصحيح. يشير السهم الأحمر إلى توقيت استخدام كلوريد البوتاسيوم. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء إجراء تجربة مشبك التصحيح في غضون أربع دقائق دون تدريب مكثف مقارنة بالترقيع اليدوي.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البصريات الوراثي وعلم العلاج الكيميائي والتلاعب الدوائي من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بمشروعك البحثي. بعد تطويرها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الدراسات عالية الإنتاجية للمستقبلات المشبكية والقنوات الأيونية في الاستعدادات المختلفة في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب مشبك التصحيح الآلي الموجه بالصور.