بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين التحضير السريع والفعال وغير المكلف لمواد هلامية بولي أكريلاميد في شكل لوحة متعددة الآبار. يتم تحقيق ذلك عن طريق الساندويتش الأول ، وهو محلول سلائف الجل بين صفيحة زجاجية مطلية كارهة للماء ودعامة بلاستيكية مرنة لاصقة من مادة الأكريلاميد. الخطوة الثانية هي تقشير الجل من اللوح الزجاجي ، الذي تم ربطه تساهميا بالدعم البلاستيكي المرن عند البلمرة وتركه يجف.

بعد ذلك ، يتم تقطيع الجل الجاف والدعم البلاستيكي المرن الأساسي إلى الأشكال المرغوبة والجانب البلاستيكي الملصق لأسفل إلى قيعان الآبار للوحة متعددة الآبار أو أي وعاء آخر لزراعة الخلايا. الخطوة الأخيرة هي طلاء المواد الهلامية متعددة الآبار المجمعة من مادة البولي أكريلاميد بطبقة لاصقة للخلية ، مثل طبقة أحادية من الكولاجين من النوع الأول. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري ، بالإضافة إلى تقنيات توصيف الخلايا الأخرى لمراقبة تأثير ركيزة بولي أكريلاميد الأساسية.

على وجه الخصوص ، صلابتها على سلوكيات الخلية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الطرق الحالية هي أنها تسمح بالتعامل مع أي صلابة وسمك للهلام البولي بالإضافة إلى تجميعها في شكل لوحة متعددة الآبار ، بطريقة منخفضة التكلفة وفعالة من الوقت ، لا توفرها طرق أخرى. سيتم توضيح الإجراء كطالب في مختبري.

أولا ، قم بإعداد محلول سلائف هلام بولي أكريلاميد عن طريق خلط مادة الأكريلاميد ، ومتشابك أكريلاميد ، والماء منزوع الأيونات يذوب Sul OPA في ثنائي ميثيل سلفوكس عند 50 ملليغرام لكل مليلتر. Aliquot 20 ميكرولترا من محلول المخزون في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة. ثم قم بالفلاش ، وقم بتجميد المحاليل في النيتروجين السائل وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإذابة الأمونيوم لكل كبريتات في الماء منزوع الأيونات لتحقيق تركيز نهائي للأمونيوم لكل كبريتات بنسبة 10٪ من الوزن من حيث الحجم. Eloqua 25 ميكرولتر من الأمونيوم لكل محلول كبريتات في 10 أنابيب طرد مركزي صغيرة ، وتخزينها سالب 20 درجة مئوية. قم بإعداد 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول الكولاجين عن طريق تخفيف محلول مخزون الكولاجين من النوع الأول في XPBS واحد عند درجة الحموضة 7.4.

يتم الاحتفاظ بجميع المحاليل على الجليد حتى الاستخدام. في هذه المرحلة ، ضع بضع قطرات من محلول كاره للماء على طبق زجاجي واستخدم المناديل الورقية لنشرها عبر السطح. بعد السماح للوحة بالجفاف في الهواء ، امسحها بالمناديل الورقية مرة أخرى لتوحيد الطلاء الكارهة للماء.

قم بقص دعامة بلاستيكية مرنة لتتناسب مع حجم اللوح الزجاجي المطلي الكارهة للماء. ثم ضع علامة على الجانب الكارهة للماء من الدعامة البلاستيكية المرنة عن طريق خدش السطح برفق باستخدام أداة حادة مثل المشرط. لتحضير الجل ، أضف 4972.5 ميكرولتر من محلول سلائف بولي أكريلاميد بالتركيز النهائي المطلوب في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ضع الأنبوب في غرفة تفريغ الغاز لمدة 30 دقيقة مع فتح الغطاء. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من الأمونيوم المحضر مسبقا لكل محلول كبريتات إلى محلول هلام DGAs لتحقيق تركيز نهائي للأمونيوم لكل كبريتات بنسبة 0.05٪ ثم أضف 2.5 ميكرولتر من TM me لتحقيق تركيز TM ME نهائي بنسبة 0.5٪ امزج المحلول برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات. بعد ذلك ، ضع فواصل السيليكون بالسماكة المطلوبة على الجانب المحب للماء من الدعامة البلاستيكية المرنة.

ثم قم بتقطيع محلول الجل على الدعامة البلاستيكية المرنة بين الفواصل والساندويتش باستخدام مصباح منزلق زجاجي مطلي كاره للماء. بعد السماح للجل بالبلمرة لمدة 45 دقيقة ، انزع الدعامة البلاستيكية المرنة باستخدام جل بولي أكريلاميد المتصل تساهميا في الأعلى واضبط جانب الجل لأعلى حتى يجف في الهواء. بمجرد أن يجف ، قم بتقطيع جل بولي أكريلاميد إلى الأشكال المرغوبة.

قم بإعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من بولي ميثيل السوان لكل 96 لوح بئر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للصق المواد الهلامية في قاع لوح متعدد الآبار. ضع قطرة صغيرة من بولي ميثيل سوان في وسط كل بئر باستخدام ملقط. ضع جل بولي أكريلاميد واحد في كل جانب دعم بلاستيكي مرن جيدا لأسفل.

بعد معالجة بولي ثنائي ميثيل سوبوكسان ، ضع كمية صغيرة من سمبا السليلوز المحضر مسبقا في كل بئر باستخدام ماصة نقل وقم باللف من جانب إلى آخر لتغطية سطح الجل بالتساوي. ضع لوحة البئر تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة لمدة خمس دقائق. عند الانتهاء ، اشطف المواد الهلامية باستخدام PBS لإزالة التشيلو الزائد.

بعد هذه الماصة، ما يقرب من 50 ميكرولترا من محلول الكولاجين المحضر مسبقا من النوع واحد في كل منها. اترك الطبق مغطى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل بعد الشطف باستخدام PBS لإزالة محلول الكولاجين الزائد. عقم المواد الهلامية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ساعتين.

أخيرا ، انقع المواد الهلامية في وسط كامل طوال الليل للترطيب والتوازن. استخدم المواد الهلامية للجلوس في الخلية على الفور أو قم بتخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى يومين معامل الشباب كدالة للعديد من مادة الأكريلاميد وثنائي الأكريلاميد وثنائي. يتم عرض تركيزات الأكريلاميد المعينة على أنها A و B على التوالي هنا كما هو متوقع.

كل من معامل التخزين G أولي ومعامل الخسارة G المزدوج أولي مستقلان عن التردد. كما تم التأكيد على أن تجفيف المواد الهلامية ثم ترطيبها لا يؤثر على معامل صغارهم. باستخدام Crosslinker Sulo sampa ، يمكن تحقيق طلاء كولاجين موحد على الهلاميات المائية من أي صلابة.

لوحظ أنه عند زرعها على مواد هلامية بولي أكريلاميد لمدة 24 ساعة ، ظلت خلايا سرطان الثدي M-D-A-M-B 2 31 مستديرة على المواد الهلامية الناعمة 0.5 وكيلو واحد من الباسكال ، لكنها كانت قادرة على الانتشار والاستطالة على هلام باسكال الصلب 100 كيلو. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهلاميات المائية المصنوعة فوق الدعامة البلاستيكية المرنة شفافة وتسمح بسهولة التصور والفحص المجهري. علاوة على ذلك ، فإن الدعم البلاستيكي المرن لا يتألق تلقائيا وبالتالي لا يتداخل مع تصوير الخلايا المصنفة بالفلورسنت.

تم تحديد مورفولوجيا الخلية بشكل أكبر من حيث مساحة انتشار الخلية الإجمالية ودائرية الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لمدى كفاءة وتكلفة تكلفة تجميع المواد الهلامية من مادة البولي أميد في شكل لوحة متعددة الآبار. لدراسة بيولوجيا الخلية المعتمدة على الصلابة.