دراسة آثار تصلب مصفوفة على وظيفة الخلوية باستخدام الأكريلاميد المستندة الهلاميات المائية

لنمذجة امتثال الأنسجة في الجسم الحي باستخدام هيدروجيلات الأكريلاميد. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء شرائح غطاء سفلية تفاعلية وشرائح غطاء علوية مـسيلكونة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في صب وإنشاء هيدروجيلات الأكريلاميد.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في ربط بروتين المصفوفة خارج الخلوية المختار بالهيدروجيل. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تحضين الخلايا وتحليلها. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف ينظم تباين مطاوعة المصفوفة خارج الخلوية في المختبر سلوك الخلايا، وذلك من خلال التحليل باستخدام مجهر التألق المناعي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، واللطخة الغربية.

سنوضح لكم اليوم إجراء تحضير واستخدام هيدروجيلات الأكريلاميد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مدى تأثير صلابة المصفوفة خارج الخلية في تنظيم مورفولوجيا الخلايا وإشارات الخلايا وتكاثرها. لذا، لنبدأ الآن.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز شرائح غطاء تفاعلية. أولاً، ضع طبقة من البارافيلم على النصف السفلي من طبق بتري بحجم 150 مليمتر. ثم انقل ما يصل إلى تسع شرائح غطاء مقطرة بحجم 25 مليمتر إلى البارافيلم وغطِّها بـ 1 مليلتر من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 مولار.

قم بتحضين شرائح التغطية لمدة ثلاث دقائق. بعد التحضين، قم بسحب هيدروكسيد الصوديوم باستخدام خط تفريغ يعمل داخل غطاء كيميائي. باستخدام ماصة، ضع 0.5 milliliters من (3-aminopropyltrimethoxysilane) أو 3-APTMS على كل شريحة تغطية. قم بتحضين شرائح التغطية لمدة ثلاث دقائق، ثم اسحب 3-APTMS. توخَّ الحذر من التحضين لفترة طويلة جدًا لتجنب تكون رغوة على الغطاء.

الشرائح الغطائية بعد المعالجة. تُشطف الشرائح الغطائية مرة واحدة باستخدام 20 milliliters من الماء منزوع الأيونات في الطبق نفسه. تُرفع الشرائح الغطائية من الطبق باستخدام ملقط منحني وتُنقل إلى طبق جديد بقطر 150 millimeter بحيث يكون الجانب المعالج متجهاً للأعلى.

بعد ذلك، اغسل الشرائح الغطائية بالماء منزوع الأيونات مرة أخرى وضعها على الهزاز لمدة 10 دقائق. وبعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة الماء واغسلها مرتين إضافيتين. من المهم جداً إزالة كل كميات A-P-T-M-S حتى لا يتفاعل مع الغلوتارالدهيد ويترك راسباً أبيض عكراً قبل 10 دقائق من استخدام الغلوتارالدهيد.

باستخدام ملاقط منحنية، انقل شرائح التغطية إلى طبق نظيف مكسو بـ param وقم بشفط أي سائل متبقٍ باستخدام خط تفريغ، ثم غطِّ كل شريحة تغطية بالكامل بـ 0.5 milliliters من 0.5%glutaraldehyde في ماء منزوع الأيونات معقم لربط A-P-T-M-S الثلاثة وهلام البولي أكريلاميد تشابكياً. قم بحضن شرائح التغطية لمدة 30 minutes في غطاء كيميائي. ثم اشفط غسول glutaraldehyde واغسل شرائح التغطية مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك، جفف شرائح التغطية تماماً. أضف شرائح تغطية جديدة إلى أنبوب فالكون سعة 50 milliliter يحتوي على محلول surface seal بتركيز 10% في الكلوروفورم، واترك الأنبوب يتأرجح لمدة 10 دقائق على الأقل. صب محلول surface seal بعيداً واترك الشرائح تجف في الهواء.

توضع شرائح الغطاء على مناديل Kim wipes داخل كابينة السلامة البيولوجية حيث سيتم تحضير الهيدروجيل للبدء في عملية التحضير. استخدم ملاقط منحنية لنقل شرائح الغطاء بحيث يكون الجانب التفاعلي للأعلى إلى ورقة من البارافورم المثبتة بشريط لاصق على سطح كابينة السلامة البيولوجية. تأكد من أن شرائح الغطاء مسطحة تماماً على سطح البارافورم.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مشبع من NHS في التولوين عن طريق إذابة كمية صغيرة من NHS في كمية كافية من التولوين. وبالنسبة للتجارب المحددة، أضف كميات صغيرة من NHS حتى لا يعود NHS قابلاً للذوبان. عادة ما يكون المحلول المشبع عكراً ووردياً.

بعد ذلك، قم بتحضير الأكريلاميد و BIS-acrylamide والماء ومحلول PS للوصول إلى نسبة الأكريلاميد المطلوبة. أضف الكواشف إلى أنابيب الميكروسنتريفيوج كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم قم بإضافة كل جزء (aliquot) على حدة.

أضف NHS و TM. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الرج (Vortex) لفترة وجيزة، ثم صب المحلول فوراً على ثلاث إلى خمس هلامات، باستخدام 140 µL لكل شريحة غطاء داخل كبائن السلامة البيولوجية. ضع بسرعة شريحة الغطاء السيليكونية مقاس 25 mm فوق كل هلام قبل أن يبدأ في البلمرة.

ستسمح إضافة غطاء الشريحة العلوي للأكريلاميد بتغطية غطاء الشريحة السفلي بالكامل. يتم تحضين هذه الطبقة المزدوجة في درجة حرارة الغرفة حتى بلمرة الأكريلاميد لتحديد وقت حدوث عملية البلمرة. تحقق من محلول الأكريلاميد المتبقي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

ستستغرق عملية البلمرة بضع دقائق بالنسبة للهلامات الصلبة وفترة أطول قليلاً للهلامات الرخوة. وبمجرد حدوث البلمرة، ارفع الشريحة المزدوجة بعناية مع ارتداء قفازات معقمة. ثم قم بإزاحة غطاء الشريحة العلوي حتى يبرز خارج نطاق الهلام المتبلمر.

بعد ذلك، قم برفع الغطاء. اسحب الهلام، وتخلص من شريحة الغطاء العلوية. ضع كل شريحة غطاء هلام سفلية، والتي سيشار إليها فيما يلي باسم hydrogel، في طبق سداسي الفجوات.

بعد ذلك، أضف 2 mL من المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات أو PBS لكل بئر من أطباق الزرع سداسية الآبار. ثم اغسل الهيدروجيل باستخدام PBS وحضنه على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل هذه مرتين.

لبدء التجربة، قم بتغطية كل هيدروجيل بـ 2 mL من محلول الفبرونكتين أو أي بروتين آخر من المصفوفة خارج الخلية. يتم تحضين البروتين على الهيدروجيل طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C للسماح له بالارتباط تساهمياً بالهيدروجيل، وبعد التحضين طوال الليل، يتم سحب محلول ECM. ثم قم بحجب مجموعات NHS غير المتفاعلة باستخدام 1 mg/mL من ألبومين المصل البقري الخالي من الأحماض الدهنية والمنشط حرارياً في وسط خالٍ من المصل، ويُحضن لمدة 30 دقيقة على الأقل عند درجة حرارة 37 °C.

بعد التحضين، اغسل الهيدروجيلات مرة واحدة باستخدام PBS معقم. بعد ذلك، ازرع الخلايا في وسط استزراع مناسب يحتوي على مصل جنين البقر. فوق الهيدروجيل هنا.

يتم استخدام أرومات ليفية جنينية للفئران مستقرة. حدد عدد الخلايا التي سيتم استزراعها على الهيدروجيل بناءً على درجة انتشار الخلايا والاندماج المطلوبين للتجربة. يلزم ما يقرب من 10⁵ خلية لتحليل لطخة ويسترن وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

ثم يتم تحضين الخلايا في ظل الظروف المناسبة لنوع الخلية المحدد. وبعد فترة التحضين، يتم استخلاص بروتين الخلية أو mRNA حسب الحاجة.

قم بنقل قطرات بحجم 100 µL من محلول التحلل (lysis buffer) باستخدام الماصة على ورقة من البارافورم على طاولة المختبر، مع ترك مسافة تتراوح بين سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تقريباً بين كل قطرة وأخرى. بعد ذلك، قم بإزالة كل هيدروجيل بعناية عن طريق رفع غطاء الشريحة السفلي من البئر، ثم استخدم ملقطاً منحنياً لوضع الهيدروجيل بحيث يكون جانب الخلايا مواجهاً للأسفل فوق القطرات.

قم بتحضين الخلايا مع محلول التحلل (lysis buffer) لمدة دقيقة واحدة بالضبط. وأخيرًا، قم بإزالة شرائح التغطية وانقل محلول التحلل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (micro centrifuge tube). وبدلاً من ذلك، عند استخلاص RNA، انقل كل هيدروجيل إلى طبق سداسي الفجوات جديد وأضف 1 mL من التريازول (triazole) لكل فجوة.

قم بتحضين الهلامات لمدة ثلاث دقائق بعد عملية التحضين. قم بإزالة محلول التريازول لتخزينه في أنبوب طرد مركزي دقيق. يعد الغسيل الشامل للشرائح الغطائية بعد إضافة A-P-T-M-S خطوة مهمة في إنتاج شرائح غطائية تفاعلية.

تكون أغطية الشرائح المغسولة والمجففة بشكل صحيح خالية من أي رواسب متبقية. سيتفاعل A-P-T-M-S مع الغلوتارالدهيد وينتج عنه راسب أبيض غائم. في حال ظهور الراسب، يجب تكرار الإجراء بالكامل لأن غطاء الشريحة لم يعد صالحاً للاستخدام.

بعد تكوين الهيدروجيل وطلائه ببروتينات المصفوفة خارج الخلوية (ECM)، يتم استزراع الخلايا طوال الليل. ويوجد فرق واضح بين انتشار الخلايا على الهيدروجيل الصلب مقابل الهيدروجيل الرخو كما يتضح من تلوين الفلوريسين (foid)، حيث تنتشر الخلايا الليفية الجنينية للفئران إلى مدى أكبر على الهيدروجيل الصلب مقارنة بالرخو. وفي الواقع، فإن معظم الخلايا التي تلتصق بهيدروجيل رخو تظل متراصة وتلتصق بكفاءة أقل.

تُظهر نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) التمثيلية لمستويات mRNA لـ cycling D one في الخلايا الليفية الجنينية للفئران أن cycling D one يزداد تعبيره بشكل ملحوظ على المصفوفة الصلبة، ولكن ليس على المصفوفة الرخوة. يشير هذا إلى أن صلابة المصفوفة تنظم تقدم الدورة الخلوية في المختبر. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إنشاء هيدروجيل بصلابة متفاوتة، لمحاكاة الظروف الفسيولوجية داخل الجسم الحي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير شرائح تغطية تفاعلية إضافية لأن الحوادث والأخطاء قد تحدث.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.