تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم نضوج عضلة الوجه وخلايا عضلة القلب في قلب الفأر الجنيني النامي. يتم تحقيق ذلك عن طريق توجيه وتجميد القلب الجنيني أولا في وسط القطع. بعد ذلك ، يتم تقسيم القلب بالتبريد في الاتجاه الصحيح.

ثم تخضع أقسام القلب لوضع العلامات المناعية الفلورية للبروتينات ذات الأهمية. أخيرا ، يتم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر لأقسام القلب ذات البقع المناعية. في النهاية ، يتم استخدام تحليلات الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد لإظهار تطور MyFi وهياكل خلايا عضلة القلب الأخرى.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطور القلب ، مثل كيفية تأثير الطفرات وجينات القلب على تجميع MyFi وظهور هياكل محددة مثل الأقراص المتداخلة والعملاء. لالتقاط القلوب الجنينية المجمدة ، استخدم درجة حرارة القطع المثلى أو وسيط OCT لملء طبق بتري 3.5 سم في غطاء كيميائي. برد. اثنان من ميثيل البوتان في النيتروجين السائل.

بعد عزل قلوب الفئران الجنينية وفقا لبروتوكول النص ، ضع القلوب في OCT واتركها تتوازن لعدة ثوان قبل نقلها إلى قالب بحجم سبعة ملليمترات يحتوي على OCT. قم بتوجيه الجدار الداخلي للقلب إلى أسفل القالب. ضع القالب برفق في النيتروجين السائل المبرد اثنين من ميثيل البوتان.

مع الحرص على عدم السماح لسائل ميثيل البوتان بلمس OCT أو تجميد القلب حتى يصبح OCT أبيض صلبا. ثم انقل القالب إلى دلو ثلج يحتوي على ثلج جاف. بعد تجميد جميع القلوب ، لف قوالب التبريد بورق الألمنيوم واحفظها سالب 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستئصال بالتبريد.

لإصلاح القلوب الجنينية ، استخدم 4٪ PFA في PBS لملء آبار لوحة زراعة 12 رقائق معدنية. بعد تشريح القلوب الجنينية وفقا لبروتوكول النص ، ضع كل قلب في بئر من PFA وثبته عند أربع درجات مئوية طوال الليل لحماية القلوب بالتبريد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، انقل كل قلب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 1.5 مل من السكروز بنسبة 15٪ في PBS وقم بتحريكه برفق عند أربع درجات مئوية حتى يغرق القلب في قاع الأنبوب. انقل كل قلب إلى 30٪ سكروز في PBS وحركه برفق عند أربع درجات مئوية حتى يغرق القلب في قاع الأنبوب.

قم بتجميد الأجنة في OCT كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. بعد وضع قوالب التبريد في غرفة ناظم التبريد وتعادل سالب 17 درجة مئوية ، اقلب قالب التبريد واستخدم ضغطا لطيفا لطرد كتلة القلب من القالب. قم بتوجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء العلوي من كتلة الأنسجة المصبوبة.

ضع قطرة كبيرة من OCT على ظرف وقم بتركيب كتلة القلب على قطرة OCT. الحفاظ على الاتجاه بحيث يكون الجدار الأمامي للقلب أبعد ما يكون عن تشاك. اسمح للقلب بالتجميد على الظرف.

قم بتحميل ظرف الظرف وكتلة القلب المثبتة على حامل كائن ناظم التبريد. اضبط بحيث تكون زاوية الشفرة من ثلاث إلى خمس درجات بالنسبة للعينة. اجمع مقاطع 10 ميكرومتر على شرائح المجهر التي تمت معالجتها مسبقا بطبقة موجبة الشحنة.

اترك العينات تجف تماما قبل تخزينها عند سالب 80 درجة مئوية لإجراء التألق المناعي. بعد تثبيت و / أو إزالة OCT من الأقسام ، استخدم عازل مانع x مخفف في PBS للحظر لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف. في حالة استخدام جسم مضاد أولي تم إنشاؤه في الفأر ، أضف حمار أو ماعز مضاد للفأر IgG H بالإضافة إلى L قطعة FAB أحادية التكافؤ مخففة من واحد إلى 100 في PBS 0.1٪ tween 20 واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع رج لطيف.

أضف الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخففة في مخزن مؤقت واحد ، واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، استخدم XPBS لغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، تم تخفيف الجسم المضاد الثانوي المترافق من واحد إلى 500 في مانع المخزن المؤقت للعينات واحتضانه محميا من الضوء لمدة ساعتين.

في درجة حرارة الغرفة ، استخدم XPBS لغسل الأقسام في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق محمية من الضوء. قم بتركيب الشرائح في وسط مضاد للبهتان عن طريق وضع قطرتين من الوسط على كل طرف من طرفي الشريحة واستخدم زلة غطاء للتغطية. استخدم طلاء الأظافر لإغلاق زلات الغطاء.

قم بتخزينه أربع درجات مئوية ، محميا من الضوء حتى يصبح جاهزا للتصوير. باستخدام أربعة x موضوعي ومضان ليزر، ابحث عن العينة ومجال الاهتمام. التقط الصورة لاستخدامها كخريطة.

عند التصوير بتكبير عالي. قم بإزالة الشريحة مع إجراء الحد الأدنى من التعديلات على مرحلة الشريحة. ثم قم بالتغيير إلى هدف الغمر بالزيت 60 ×.

ضع قطرة صغيرة من الزيت على الهدف واستبدل الشريحة على مرحلة الشريحة. بعد ذلك ، ابحث عن العينة مرة أخرى ، واضبط وقت التعرض لطاقة الليزر والتجميع على المستويات المطلوبة لكل قناة. بمجرد تحديد الإعدادات المثلى وفقا لإرشادات بروتوكول النص ، استخدم إعدادات العينة لجميع أقسام الأنسجة داخل التجربة.

استخدم الرسم البياني للشدة لملاحظة نطاق الشدة الأمثل لكل قناة ، والذي سيتم استخدامه للتحليل. قم بإنشاء Zack باستخدام وظيفة الاستحواذ عن طريق تحديد قنوات الليزر المناسبة. ثم اختر الحدود العليا والدنيا لمكدس Z.

اختر حجم خطوة Zack الذي يمثل نصف قيمة سمك الشريحة الضوئية التي يوفرها البرنامج. انقر فوق تشغيل لجمع الصور باستخدام فيجي أو برنامج مماثل لتحليل الصور. افتح ملف Zack باستخدام خيار وضع اللون المخصص وتنقسم القنوات إلى نوافذ منفصلة.

من القائمة المنسدلة للصورة، افتح أداة ضبط تباين السطوع وداخل كل قناة قم بتعيين نطاق شدة الرسم البياني الأمثل. كما هو محدد سابقا ، قم بتطبيق نطاقات القنوات هذه على جميع Zacks التي يتم تحليلها. ثم من لون الصورة ، اسحب القائمة لأسفل ، ودمج القنوات الفردية في صورة مركبة واحدة.

باستخدام قائمة مشروع Stacks Z للصورة، قم بإنشاء مكدس Z مسطح من الصورة المركبة. نظرا لأن هذه الصورة ستكون أكثر إشراقا بكثير من الصورة ثلاثية الأبعاد ، اضبط نطاق شدة الرسم البياني لعينة التحكم لتجنب التشبع المفرط وتطبيق نفس الإعدادات على Zack المسطح التجريبي لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد ، اختر أولا قائمة مشروع مكدسات الصور ثلاثية الأبعاد. اختر إما المحور x أو المحور Y.

قم بتعيين تباعد الشرائح بنفس عدد الميكرونات مثل حجم خطوة المكدس Z. اختر الدوران الكلي المطلوب واضبط زيادة زاوية الدوران على واحد. ثم افتح عارض الصورة J 3D من القائمة المنسدلة للمكونات الإضافية.

اختر شاشة الصورة المركبة التي تم إنشاؤها كوحدة تخزين واضبط عامل إعادة التشكيل على واحد أو اثنين. تظهر هذه الأرقام نتائج نموذجية لتلوين البروتينات المختلفة في مجمدة سريعة ، وقلب ثابت من الأسيتون ، والجسم المضاد ضد أقراص Z المسماة بشكل متكرر ، وفي الأقراص المتداخلة ذات الخصوصية العالية والحد الأدنى من الخلفية. الجسم المضاد ضد بروتين تقاطع الالتصاق بيتا كاتينين يربط غشاء كل من خلايا عضلة القلب والخلايا غير عضلية القلب وحدث التموضع مع SFA actinin في الأقراص المتداخلة المفترضة في E 16.5 بيتا واحد يعد التألق المناعي Integrin في القلب الجنيني تحديا خاصا ، لكن تلطيخ بيتا واحد إنتجرين في هذه الدراسات كشف عن إشارة بنفس الدورية مثل SFA Actinin المسمى أقراص Z ، ربما يعكس العملاء الناشئين الذين تشكلوا في E 16.5.

في E 12.5 ، أظهر نمط تلطيخ الأكتينين و tropo mycin SFA دورية منتظمة في خلايا عضلة القلب التربيقية المتوافقة مع اللييفات العضلية الناضجة في المنطقة المدمجة الخارجية ، كان الأكتينين SFA أكثر ثقبا من الخطي وكانت إشارة الميوسين التروبو منتشرة بدلا من تلطيخ NCA الخطي وخلايا عضلة القلب التربيقية في E 12.5 قلوب موضعية مع مناطق تلطيخ الأكتينين الشديد SFA ربما تمثل أقرصا متداخلة. يظهر هنا قلب جنيني ثابت PFA E 12.5 المسمى ل SFA actinin و acton الخيطي من فأر معدل وراثيا RFP Ruby. انخفضت نسبة الأكتين SFA المشار إليها إلى الضوضاء مقارنة بأقسام القلب المجمدة.

كشفت إعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد أن MyFi داخل خلية عضلة القلب كانت متوازية تقريبا مع بعضها البعض ، لكن خلايا عضلة القلب الفردية كانت موجهة بزوايا متفاوتة بالنسبة لبعضها البعض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توجيه القلوب الجنينية وتقسيمها بشكل صحيح ، بالإضافة إلى إجراء تلطيخ مناعي ، وفحص مجهري متحد البؤر ، وتحليل الصور لتقييم MyFi ونضج خلايا عضلة القلب أثناء نمو قلب الفأر. اعترف.