تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي
أبريل 17, 2019
نقدم البروتوكولات لدراسة التنمية قلب الماوس باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت على الأجنة الماوس تشريح من البطين محددة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. هذا الأسلوب يسمح لنا بتصور كل مرحلة تشكيل البطين خلال الماوس قلب التنمية دون أساليب histochemical كثيفة العمالة مباشرة.
باستخدام هذه الطريقة يمكننا اختبار تكوين أنبوب القلب مباشرة ، وال حلقات ، وتشكيل غرفة كاملة دون مزيد من التلاعب التجريبية من جنين الماوس. على الرغم من أننا نستخدم MLC-2v-tdTomato الفئران كمثال على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة على نطاق واسع مع خطوط الماوس مراسل الفلورسنت الأخرى. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه بسيط جدا ولا يتطلب أي تقنيات معقدة أو معدات.
ويمكن أن يؤديها في إعداد مختبر العادية. بعد التزاوج الإناث مع الفئران الذكور، سواء MLC-2v-tdTomato 8 إلى 10 أسابيع من العمر، والتحقق من السدود لمقابس المهبل كل صباح. وضع السدود الحوامل, القتل الرحيم في أيام مختلفة بعد coitum, في موقف supine ورش البطن مع 70٪ الإيثانول.
استخدام مقص الجراحية الحادة والملقط لفتح تجويف البطن عن طريق شق من كل من الجلد وجدار البطن. بعد تحديد مواقع قرون الرحم الثنائية في الجزء الظهري من تجويف البطن ، قم بفصل الرحم بأكمله باستخدام مقص جراحي حاد وملقط لقطع بعناية فوق oviducts على كلا الجانبين. ضع الرحم الكامل المُشَرَّح في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات مع PBS بارد.
باستخدام مقص جراحية حادة والملقط، وفصل بعناية كل كيس السلوي على طول قرن الرحم. استخدم ملاقط لنقل كل جنين إلى لوحة ثقافة 35 ملليمتر مليئة بـ PBS البارد. باستخدام مقص وجراحي حاد، وفتح كيس السلوي وفضح كل جنين عن طريق قطع الحبل السري ومن ثم تقليم الأنسجة الجنينية اضافية قدر الإمكان دون الإضرار الأجنة.
تحت مجهر تشريح مع الألياف البصرية المجهر الإضاءة، وقطع رأس الجنين ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 100 ميكرولترات من العازلة A لgenotyping في وقت لاحق لربط مع نتائج التصوير epifluorescent. باستخدام ملقط غرامة، وفتح صدر الجنين. مع مقص جراحي حاد وملقط، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية.
استخدام ملاقط لنقل القلب الجنينية تشريح في لوحة ثقافة 35 ملليمتر مع برنامج تلفزيوني. ضع الطبق مع قلوب جنينية الماوس تحت مجهر تشريح الفرجورات. استخدام ملقط غرامة لوضع قلوب الجنينية بحيث البطينين النامية تواجه الفاحص.
اضبط التركيز باستخدام هدف 0.63x في وضع الحقل الساطع. التقط التعرض في المجال الساطع والتقاط صور متعددة. لتصور التعبير tdTomato، إيقاف الإضاءة المجهر الألياف البصرية وتعيين مرشح لفلوريسنس الأحمر.
إعادة التركيز على الصورة إذا لزم الأمر، وضبط السطوع والتباين، واتخاذ التعرض الفلورسنت الحمراء، والتقاط صور متعددة. بالنسبة للجنينات، قم بغلي عينات الرأس المعزولة سابقًا في المخزن المؤقت A عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 11، 360 مرات G.Transfer 20 ميكرولترات من عظمى إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر مع 20 ميكرولترات من العازلة B ومزيج.
استخدام 4.5 ميكرولترات من supernatant مختلطة كقالب الحمض النووي والجمع بين ذلك مع 0.5 ميكرولترات من كل من 10 micromolar محددة إلى الأمام وايبائة عكسها، 10 ميكرولترات من 2x premixed البوليمرات والعازل التفاعل ومن ثم إضافة الماء إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. تشغيل PCR كما هو موضح في المخطوطة. تحميل التفاعل الانتهاء في 100 سلم الحمض النووي زوج قاعدة على هلام agarose 1٪وتشغيلها في 140 فولت في 1x TAE العازلة لمدة 25 دقيقة.
ضع الجل المكتمل على ترانيلوميناتوريناتور الأشعة فوق البنفسجية واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتحديد نطاقات الحمض النووي. ويعتبر MLC-2V ليكون أقرب علامة لمواصفات غرفة البطين أثناء تطور القلب. في MLC-2v-tdTomato مراسل طرق في الفئران، والتعبير ضعيفة نسبيا من tdTomato في أنبوب القلب الخطي في E8.0 يصبح أقوى في E8.5 كما هو مبين باستخدام كامل جبل التصوير الظهارية من الأجنة.
باستخدام كامل جبل تصوير التحلل من القلب تشريح، يمكن بسهولة تحديد تشكيل غرفة البطين أثناء تطوير القلب الماوس. في القلب تشريح من جنين الماوس كله في E10.5، تم عرض التعبير مراسل MLC-2v-tdTomato في الجزء البطيني من القلب وليس في المسالك الداخلية، المسالك الخارجة، أو الأذين المستقبل. في E12.5 إلى E13.5، يتم التعبير عن مراسل tdTomato حصريا في البطينين من القلب أربع غرف.
وقد ظهر نمط التعبير الخاص بالبطين المماثل في جنين الفأرة المُشرَّح في E16.5. بعد التصوير كله، تم تحديد النمط الجيني للأجنة باستخدام مجموعتين من التمهيديات لـ PCR genotyping، مما يؤكد الأجنة المتجانسة التي تحمل الأليلية، غير المتروزيغو، والأجنة البرية. هذا الأسلوب هو جميلة بسيطة وبسيطة لتنفيذ.
الخطوة الحاسمة هي تشريح القلوب الجنينية. فهم تشريح القلب أثناء تطور القلب ضروري لعزل القلب بنجاح عن الجنين بأكمله.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات لفحص تطور قلب الفئران باستخدام المجهر الفلوري فوق البؤري للعينات الكاملة على فئران من سلالة MLC-2v-tdTomato reporter knock-in. تتيح هذه الطريقة التصوير المباشر لمراحل تكوين البطينات دون الحاجة إلى تقنيات كيميائية نسيجية معقدة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا التنموية
- أبحاث القلب والأوعية الدموية
خلفية علمية
- يُعد تطور القلب مجالاً حيوياً للدراسة في علم الأحياء النمائي.
- يمكن أن تتطلب الطرق التقليدية لدراسة شكل القلب جهداً مكثفاً.
- توفر الفئران التي تحمل مراسل فلوري نهجاً مبتكراً لتصوير تراكيب القلب.
- تُعد فئران MLC-2v-tdTomato نموذجاً مفيداً لهذه الدراسات.
الهدف من الدراسة
- توفير طريقة بسيطة لتصوير مراحل تطور القلب.
- إظهار فائدة الفئران ذات المراسل الفلوري في الدراسات التنموية.
- تسهيل الأبحاث دون الحاجة إلى تقنيات معقدة.
الطرق المستخدمة
- الفحص المجهري الفلوري للعينة الكاملة.
- استخدام الفئران التي تحتوي على جين مُبلّغ مُدمج من نوع MLC-2v-tdTomato.
- تشريح الأجنة في مراحل نمو مختلفة.
- إعداد تجريبي بسيط مناسب لبيئات المختبرات العادية.
النتائج الرئيسية
- نجاح تصور تكوين الأنبوب القلبي والتلوّي.
- ملاحظة واضحة لتكوين الحجرات الكاملة.
- طريقة قابلة للتطبيق على سلالات الفئران الأخرى التي تحتوي على مراسل فلوري.
- أثبت البروتوكول سهولة الاستخدام في بيئة مختبرية قياسية.
الاستنتاجات
- تُبسط الطريقة المعروضة دراسة تطور القلب.
- تتيح هذه الطريقة للباحثين تصور المراحل الحرجة دون الحاجة إلى إجراءات معقدة.
- يمكن لهذا النهج أن يعزز فهم التشكل القلبي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول التصوير المباشر لتشكّل غرف البطين في أجنة الفئران باستخدام خطوط المراسل الفلورية، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية القلبية الوعائية. ومن خلال تبسيط تقييم مورفولوجيا القلب دون الحاجة إلى كيمياء نسيجية معقدة، يعزز هذا النهج من عملية تقليل المخاطر الميكانيكية للمسارات التطورية. كما يوفر هذا الأسلوب ثقة تنبؤية لتقييم تأثيرات المركبات على التشكّل القلبي في النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استجواب آليات تحديد هوية البطين باستخدام MLC-2v كعلامة مبكرة لتطور حجرات القلب.
- القيمة التشغيلية: يدعم التحقق من الهدف الوظيفي من خلال الربط المباشر بين المراسلين الجينيين وتكوين بنية القلب.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة بيولوجية مُعتمدة لفحص المركبات اللاحق من خلال تحديد المورفولوجيا الأساسية للبطين.
- القيمة التشغيلية: تمكين توحيد المقايسات من خلال التصوير الفلوري فوقي (epifluorescent) القابل للتكرار للعينة الكاملة عبر المراحل التنموية.
الأبحاث الترجمية والسريرية الأولية
- القيمة العلمية: يوفر نظاماً ذا صلة بالأمراض لدراسة مسارات التخلق القلبي المحفوظة عبر الفقاريات.
- القيمة التشغيلية: يسهل مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال ربط تعبير tdTomato بنضج غرف البطين.
تكاملات مسار العمل وسير العمل
تدمج هذه الطريقة في سير عمل بيولوجيا الاكتشاف من خلال تمكين التقييم المباشر للأنماط الظاهرية الهيكلية القلبية بعد الاضطراب الجيني أو الدوائي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار فرضيات الجينات أو المركبات التي تؤثر على التواء الأنبوب القلبي وتجزئة الحجرات.
- الفحص: توفر قراءات فلورية كمية لمقارنة تكوين البطين عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- التحليلات: تولد قياسات مكانية وقائمة على الكثافة لتعبير tdTomato لتقييم خصوصية البطين.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نمط تكوين البطين المبكر بالاستمرارية قبل السريرية من خلال آليات نمو محفوظة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق على خطوط مراسل فلورية متعددة تتجاوز MLC-2v-tdTomato.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال تقليل الغموض في تقييم تكوين حجرات البطين.
- القيمة التشغيلية: تحسن قابلية التكرار من خلال بروتوكولات التشريح والتصوير الموحدة في الإعدادات المختبرية العادية.
- القيمة الاستراتيجية: تعزز كفاءة رأس المال من خلال تمكين اتخاذ قرارات مبكرة بالاستمرار أو التوقف بناءً على الأنماط الظاهرية للهياكل القلبية.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تحديد المسؤوليات التنموية في المركبات الرائدة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح أجنة الفئران وتحديد التشريح القلبي.
- يعتمد على المجهر الفلوري بوجود مجموعات مرشحات مناسبة للكشف عن tdTomato.
- يستلزم توحيد إجراءات تحديد مراحل تطور الجنين وعزل القلب بين المستخدمين.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التطبيق على خطوط مراسل فلورية مختلفة ذات أنماط تعبير متباينة.
- يقتصر بسبب الحاجة إلى الوصول إلى الأنسجة الجنينية، مما يحصر الاستخدام في الدراسات التطورية خارج الجسم (ex vivo).
