تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

في هذا الفيديو ، سوف نوضح كيف يمكن استخدام البقعة النسيجية الشائعة جدا الميثيل الأخضر كملصق نووي مناسب للغاية في المجهر الفلوري مع التطبيقات الخاصة في الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر للعينات البيولوجية السميكة مثل الأجنة الكاملة. بعد تقديم الميثيل الأخضر بصفته بقعة خاصة بالحمض النووي ، سنصف طريقة تحضير المخزون وحلول العمل لتلوين الفلورسنت. سنعرض بعد ذلك الإجراء التجريبي لتحقيق التلوين النووي والاحتفاظ بالعديد من أجنة الأسماك وأمثلة على الصور متحد البؤر التي تم الحصول عليها.

أخيرا ، سيتم عرض الخصائص الكيميائية الفيزيائية الممتازة للميثيل الأخضر ومناقشتها. اكتشف فريدي ميشا الحمض النووي في عام 1869 وأظهر بعد بضع سنوات أنه شكل رواسب ذات لون حولي جديد نسبيا وصبغة خضراء ميثيل جديدة. يحتوي الميثيل الأخضر على شحنتين موجبة تسمحان له بالتفاعل بقوة مع الحمض النووي في مجموعته الرئيسية المرتبطة بشكل تفضيلي بمناطق الوصول.

الاستخدام الأكثر شمولا للميثيل الأخضر هو مزيجه في محلول الأنف مع الحمض النووي الريبي صبغة بيرين ، وهو ميثيل طورته UNA و Poppen Heim في بداية القرن العشرين. ومع ذلك ، فقد تم تحليل القليل جدا من الخصائص الفلورية للميثيل الأخضر ، ولهذا السبب قررنا اختبار إمكانية استخدامه كتقارب عال جدا وملصق فلوري محدد. للحمض النووي على الخلايا.

الميثيل الأخضر هو وصمة عار الميثان مع سبعة جذور ميثيل. تضيع هذه المجموعة السابعة بسهولة وتعود إلى البنفسجي الكريستالي. لهذا السبب ، هناك كمية وصول من البنفسج البلوري الممزوج بالميثيل الأخضر لإزالة الكريستال.

يمكن غسل محلول ميثيل البنفسجي الأخضر بالكلوروفورم لاستخراج البنفسج البلوري. كما سنوضح على الفور لهذا الغرض ، نقوم بإعداد محلول ACU بنسبة 4٪ تحت غطاء الدخان. نخلطها مع جزأين على الأقل من الكلوروفورم وأجهزة الطرد المركزي لتسريع فصل الطور.

بعد التمركز ، نحصل على مرحلة مائية مع الميثيل الأخضر ومرحلة عضوية أقل مع الكلوروفورم والبنفسج البلوري. استعدنا المرحلة العليا وكررنا حتى تبدو المرحلة السفلية واضحة. في النهاية ، يتم استرداد المرحلة العليا وتخفيفها.

هذا هو الحل مستقر على طاولة العمل لعدة أشهر. سنوضح الآن كيفية المضي قدما في الميل إلى MO الكامل في طبقة الأجنة مع الميثامفيتامين الأخضر. بالنسبة للتدقيق الكهربائي متحد البؤر ، سنستخدم جنين الأسماك عالي الزرع.

على سبيل المثال ، احصل على أجنة الزرد واغسل الحطام بمصفاة. احتضنها إلى المرحلة المرغوبة في مياه حوض الأسماك أو وسط الجنين. قم بإزالة الكوريوم بملاقط ناعمة ، وقم بتثبيت الأجنة في 4٪ للفورمالديهايد لهذه الساعات القليلة أو بين عشية وضحاها.

ثم اغسل الأجنة في PBST لعدة مرات. قم بإعداد محلول عمل ميثيل أخضر عن طريق تخفيف محلول المخزون من خمس إلى 10 ، 000 مرة في PBST. احتضان الأجنة في المحلول لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها أربع درجات مئوية منخفضة.

في هذا المثال ، سيتم الحصول على صور متحد البؤر في مجهر متحد البؤر أقل مع أجهزة الكشف الطيفية. يتم تحقيق الإثارة القصوى باستخدام ليزر 633 نانومتر ويتم ضبط الكاشف على نطاق واسع. في المنطقة الحمراء من الطيف المرئي.

يتيح انبعاث الميثيل الأخضر الأحمر الحصول على تصوير نووي عالي الجودة حتى من العينات العميقة مثل الأجنة الكاملة مع الحد الأدنى من فقدان الإشارة. تظهر هذه السلسلة الأولى شبكية السمك الزرد التي تلطخت نواتها بصبغة حمض نووي راسخة للمحترفين ثلاثة. بعد دقيقة واحدة نقوم بالتصغير.

تصبح منطقة مسح ABL واضحة عندما نجري نفس التجربة باستخدام الميثيل الأخضر ، ولا يرى أي تبييض واضح. في السلسلة التالية ، نعرض نتائج تمثيلية لما يمكن الحصول عليه باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، الخلية الانقسامية من بشرة الزرد التي يمكن فيها ملاحظة الأشكال الانقسامية. نواة IIC من نفس العينة حيث يمكن رؤية العمارة النووية.

إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لجزء من يرقات الزرد خلية بشرة مسمى بالميثيل الأخضر أمالين ، منظر أكثر بانورامية للأشكال النووية المختلفة في غضون 48 ساعة من الإخصاب ، السمكة الفضية ، شبكية العين br. لقد أظهرنا هنا طريقة سهلة لإعداد صبغة الحمض النووي الفلورية غير مكلفة للغاية والتي يمكن استخدامها في التسمية النووية, على الرغم من أننا نعرض فقط كمثال, من عقد عدة. يمكن أن تنطبق هذه التقنية على الأجنة أو الأنسجة ، إما كاملة أو مقطعية.

يمكن استخدامه أيضا لتلوين الحمض النووي في المواد الهلامية ولتحديد الحمض النووي في المحلول باستخدام القياس الضوئي.