التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة
مايو 14, 2015
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة أحادية الطبقة الخالية من المصل. يمكن استخدام هذه الأسلاف لاشتقاق أنواع الخلايا العصبية الناضجة أو لدراسة عملية المواصفات العصبية وهي قابلة لتحجيم تنسيق متعدد الآبار للفحص المركب.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى سلالة عصبية في مستنبت خلوي أحادي الطبقة خالي من المصل. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طلاء وعاء الاستنبات بالجيلاتين. وفي الخطوة الثانية، يتم تجميع الخلايا الجذعية الجنينية في معلق خلوي أحادي في وسط التمايز وتخفيفها إلى كثافات الزرع المناسبة.
في الخطوة النهائية، يتم استزراع الخلايا على الطبق المطلي بـ gel ENC. وفي الختام، يُستخدم المجهر الفلوري المناعي للتأكد من نجاح التمايز من خلال تصوير العلامات العصبية المستهدفة. وبوجه عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، حيث يُعد استزراع الخلايا بكثافة مناسبة أمراً حاسماً لتحقيق تمايز جيد.
وهناك عدة عوامل تؤثر على كثافة الزرع بشكل مباشر وغير مباشر. قبل زرع الخلايا، قم بتدفئة جزء من الجيلاتين بتركيز 1% في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C حتى يذوب. بعد ذلك، اخلط الجيلاتين مع 500 milliliters من محلول PBS الدافئ، وقم بتغطية قاع وعاء زراعة الخلايا بكمية كافية من المحلول لطلاء السطح أثناء عملية التغطية بالجيلاتين.
اشطف المزرعة غير المتلاحمة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر مرتين باستخدام PBS. ثم أضف واحد ملليلتر من كاشف التفكيك إلى المزرعة. بعد مرور دقيقتين إلى خمس دقائق، قم بالنقر على الوعاء لفصل الطبقة الواحدة وتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة، وجمع المزرعة في إجمالي 10 ملليلتر من الوسط وكاشف تفكيك الخلايا.
انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter وقم بطردها مركزياً في جهاز الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بسحب السائل الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من N two B 27 مسبق التدفئة عن طريق نقره مقابل جدار الأنبوب. ولتجنب تكوين الفقاعات، قم الآن بعدّ الخلايا وتسجيل التركيز، ثم أعد تعليقها بعدد الخلايا المناسب لكل وحدة حجم لكل بئر في N two B 27 مسبق التدفئة وفقاً للجدول.
بعد ذلك، قم بشفط الجيلاتين من وعاء الزراعة وانثر الخلايا دون تدوير الوعاء. ضع المزارع في حاضنة رطبة عند 37 °C و5% carbon dioxide، مع استبدال الوسط كل يوم إلى يومين.
باستخدام N two B 27 الطازج، ستبدأ الخلايا في التمايز وإظهار تعبير Sox1 خلال أربعة إلى ستة أيام، وذلك لصبغ الخلايا من أجل التصوير المناعي الفلوري. قم بإزالة وسط التمايز من المزارع وثبّت الخلايا في 500 µL من البارافورمالدهيد بتركيز 4%. بعد 15 دقيقة، اغسل الخلايا ونفّذ إليها مرتين باستخدام 2 mL من PBS مع tween. بعد ذلك، قم بحجب أي ارتباط غير نوعي من خلال تحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة.
في واحد مليليتر من PBS tween المدعم بالمصل على هزاز أطباق بعد غسل الخلايا كما تم توضيحه للتو. تُضاف 500 ميكرولتر من IgG للفأر ضد beta three tubulin إلى المزارع للحضن طوال الليل على هزاز الأطباق عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي.
بعد غسل الخلايا، تُحضن العينات في جسم مضاد ثانوي مضاد لـ US IgG مُوسوم بفلوريسنت في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء والرج لمدة ساعة واحدة. تُشطف الخلايا مرة أخرى وتُصبغ في 500 microliters من DPI لمدة خمس دقائق. وأخيراً، بعد غسل الخلايا للمرة الأخيرة، تُحفظ في PBS tween لمدة تصل إلى أسبوعين في درجة حرارة 4 °C.
حتى يتم التصوير. في هذه التجربة، استُخدمت خلايا جذعية جنينية للفئران تحتوي على مراسل GFP داخلي لـ SOX 1 لتتبع التمايز العصبي. وفي اليوم السادس، تم تثبيت الخلايا وصبغها باستخدام المؤشر العصبي beta three tubulin.
عند الكثافة المثالية، تمايزت الخلايا إلى سلائف عصبية وعصبونات، بينما أدى وضعها بكثافة أعلى إلى انخفاض عدد الخلايا الموجبة لـ SOX one GFP و beta three tubulin. كما يؤثر حجم وعاء المزرعة الخلوية على كثافة الزرع المثالية أيضاً؛ فعلى سبيل المثال، تتطلب الخلايا التي تنمو في طبق ذي 96 بئراً كثافة خلوية أعلى بحوالي 10 مرات من تلك الكثافة.
تُزرع الخلايا في أطباق زراعة ذات ستة آبار للوصول إلى كثافتين خلويتين من حيث درجة التلاحم، إحداهما مثالية والأخرى ثانوية. تتغير مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية تدريجياً أثناء التمايز. على سبيل المثال، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الخلايا والمستعمرات من اليوم الأول إلى السادس بعد البدء عند الكثافة الخلوية المثالية في هذه الصور.
في اليوم الرابع، تبدأ الخلايا في التحول إلى خلايا عصبية سلفية، وهو ما يتضح من ظهور إشارة فلورية خضراء من مراسل SOX 1 GFP. وبحلول اليوم السادس، تصبح معظم الخلايا موجبة لـ SOX 1، على الرغم من أن وجود بعض الخلايا غير العصبية هو أمر متوقع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية بدء التمايز العصبي لخلايا الجنين الجذعية للفأر في مستنبت خلوي أحادي الطبقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى سلائف عصبية باستخدام طريقة الطبقة الواحدة الخالية من المصل. يتيح هذا النهج توليد أنواع ناضجة من الخلايا العصبية، وهو مناسب للتوسع في تنسيقات الأطباق متعددة الآبار لغرض فحص المركبات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث الخلايا الجذعية
الخلفية العلمية
- يمكن للخلايا الجذعية الجنينية أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- تعد السلائف العصبية ضرورية لدراسة التطور العصبي.
- يمكن لطرق الزراعة الخالية من المصل أن تعزز إمكانية تكرار النتائج.
- تعتبر كثافة الزرع المناسبة أمراً بالغ الأهمية لنجاح عملية التمايز.
الغرض من الدراسة
- تأسيس طريقة موثوقة لتوليد السلائف العصبية.
- تسهيل دراسة عمليات التخصيص العصبي.
- تمكين الفحص عالي الإنتاجية للمركبات التي تؤثر على التمايز العصبي.
الطرق المستخدمة
- طلاء أوعية الزرع بالجيلاتين.
- تحضير معلق خلوي أحادي من الخلايا الجذعية الجنينية.
- استزراع الخلايا على الأطباق المطلية بالجيلاتين.
- استخدام مجهر التألق المناعي للتأكد من نجاح التمايز.
النتائج الرئيسية
- تمايز ناجح للخلايا الجذعية الجنينية إلى سلفيات عصبية.
- تأكيد التمايز من خلال تصوير المؤشرات العصبية.
- تحديد كثافات الزرع المثلى لتحقيق تمايز فعال.
- تتميز الطريقة بقابليتها للتوسع لاستخدامها في تطبيقات فحص المركبات.
الاستنتاجات
- تعد طريقة الطبقة الأحادية الخالية من المصل فعالة في توليد الخلايا العصبية السلفية.
- يعتبر التألق المناعي تقنية موثوقة لتقييم التمايز.
- يمكن تكييف هذا البروتوكول لمختلف التطبيقات البحثية في مجال العلوم العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا البروتوكول توليداً قابلاً للتوسيع للخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفئران في نظام أحادي الطبقة محدد وخالٍ من المصل، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتقليل المخاطر الميكانيكية في عملية اكتشاف أدوية العلوم العصبية. توفر هذه الطريقة منصة كمية قابلة للتكرار لتقييم تأثيرات المركبات على التمايز العصبي، مما يسهل تحديد المركبات الرائدة وتعزيز الثقة التنبؤية في مسارات التطوير قبل السريرية. وتسمح قابليتها للتوافق مع خطوط المراسل وتنسيقات الزراعة عالية الكثافة بدمجها في سير عمل الفحص لدراسات تعديل المسارات والارتباط بالهدف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء آليات التحديد العصبي والتحقق الوظيفي من أهداف التطور العصبي من خلال التمايز الموجه.
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً محدداً وخالياً من المصل، مما يقلل من التباين ويعزز قابلية التكرار عبر التجارب والخطوط الخلوية المختلفة.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقييم التغيرات التي تحثها المركبات في إنتاجية السلف العصبي وتعبير المؤشرات، مما يفيد في تحديد مدى الارتباط بالهدف وتعديل المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية السلفية المناسبة لفحص المركبات والتقييم المظهري للتمايز العصبي.
- القيمة التشغيلية: قابلة للتكيف مع تنسيقات الأطباق متعددة الآبار (مثل أطباق 96 بئرًا) مع إمكانية تحسين كثافة الزرع القابلة للتوسع، مما يتيح تطبيقات متوسطة إلى عالية الإنتاجية.
- جاهزية المقايسة: متوافقة مع التألق المناعي، وقياس التدفق الخلوي، والقراءات الجزيئية للتحليل متعدد المعايير لكفاءة التمايز والتعبير عن العلامات.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تسمح بالانتقال من توليد الخلايا العصبية السلفية إلى نضج العصبونات والخلايا الدبقية الوظيفية، مما يدعم النمذجة ذات الصلة بالأمراض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تسهل دراسة تحديد السلالة وديناميكيات التمايز باستخدام خطوط مراسلة (مثل SOX1-GFP) لمراقبة التخصيص العصبي في الوقت الفعلي.
- الفائدة قبل السريرية: تمكّن من تقييم تأثيرات المركبات على النضج العصبي والتمايز الدبقي، مما يدعم دراسات علم الصيدلة الخاص بالسلامة ودراسات آلية العمل.
تكامل سير العمل ومسار المعالجة
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات المبكرة، حيث تدعم عملية التحقق من الهدف من خلال الاستقصاء الميكانيكي للتمايز العصبي، وتتيح تطوير المقايسات اللازمة لفحص المركبات في محافظ أبحاث العلوم العصبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات التطور العصبي والتحقق من الأهداف من خلال التمايز الموجه والقراءات القائمة على العلامات الحيوية.
- المسح: تتيح توحيد المقايسات وإعادة إنتاجها في المزارع أحادية الطبقة، حيث تعد كثافة الزرع معلمة حرجة لضمان توليد متسق للخلايا العصبية السلفية.
- التحليلات: توفر مخرجات كمية عبر التألق المناعي (مثل SOX1-GFP و βIII-tubulin) وقياس التدفق الخلوي لقياس كفاءة التمايز والاستجابة للمركبات.
- البحث الانتقالي: تربط عملية توليد الخلايا العصبية السلفية المبكرة بالنضج اللاحق إلى عصبونات وخلايا دبقية وظيفية، مما يدعم الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يدعم البروتوكول المحدد والقابل للتوسع إعادة الاستخدام عبر خطوط متعددة من خلايا ESC، وأوعية زراعة مختلفة، وحملات مسح متنوعة، مما يقلل من جهود إعادة التطوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في مسارات التمايز العصبي.
- القيمة التشغيلية: تؤدي الظروف الموحدة الخالية من المصل إلى تحسين قابلية التكرار والتوسع عبر المختبرات وخطوط الخلايا المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين التقييم المبكر لتأثيرات المركبات على الالتزام بالسلالة العصبية وكفاءة التمايز.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات للأهداف العصبية بناءً على المخاطر المعدلة من خلال تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من صحة المسارات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية، وتقنيات التمايز، والمجهر الفلوري المناعي.
- يعتمد على توفر حضانات CO2، وأجهزة طرد مركزي، ومجاهر، وكواشف مثل الجيلاتين، وN2B27، وكواشف التفكيك، والأجسام المضادة.
- يستلزم توحيد كثافة الزرع وإجراءات طلاء الجيلاتين بين المستخدمين والمواقع لضمان قابلية التكرار.
- قد يتطلب التكيف مع سلالات ESC المختلفة أو تركيبات المراسل تحسيناً لكثافة الاستزراع وتوقيت التمايز.
- تشمل القيود العملية الحساسية تجاه كثافة الزرع والحاجة إلى تفكيك دقيق للطبقة أحادية الخلية لتجنب التكتل أو عدم اكتمال معلق الخلايا المفردة.
