الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي ( Microcystis الزنجارية) باستخدام التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إنشاء بروتوكول يمكنه تحليل الحالة الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء بشكل فعال ، باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول فسيولوجيا الخلية للمجتمعات الميكروبية. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أن بروتوكول مسبار الفلورسنت المحسن يمكن أن يميز بين الحالات الفسيولوجية للبكتيريا الزرقاء على مستوى الخلية الفردية في الوقت الفعلي.

سيوضح هذا الإجراء ديفيد هارتنيل ، طالب الدكتوراه الذي يعمل في مختبر قياس الخلايا في جامعة بورنموث. قبل بدء التجربة ، ضع أنبوب انحلال الدم فارغا على مسبار حقن العينة. انقر فوق unlog.

ثم التدفق مرة أخرى لبدء عملية تنظيف قياس التدفق الخلوي. في نهاية التدفق الخلفي ، قم بتحميل أنبوب انحلال الدم الجديد الذي يحتوي على ملليلترين من الماء المصفى فائق النقاء على مسبار حقن العينة ، أو SIP ، واضبط الحد الزمني على 10 إلى 15 دقيقة ، وسرعة السوائل على السرعة. بعد ذلك ، حدد خلية بيانات جديدة ، وقم بتعيين عتبات التألق والتشتت الخفيف ذات الصلة لتقليل ضوضاء الخلفية.

ثم انقر فوق تشغيل. إذا كان إجمالي الأحداث في الثانية لا يقل عن توصية الشركة المصنعة ، فقم بتشغيل ملليلترين من محلول إزالة التلوث لمدة دقيقتين بسرعة. وكرر خطوات تدفق الظهر وتنظيف المياه فائقة النقاء.

لتحضير الزراعة الأحادية الأولية M.aeruginosa ، قم بالأوتوكلاف 98 مل من الماء المصفى فائق النقاء ، ممزوجا بملليلترين من وسط الطحالب ، في دورق سعة 250 مليلتر لمدة 20 دقيقة عند 120 درجة مئوية. عندما تكون الثقافة في حالة عالية من الكثافة المستقرة ، قم بتقسيم ملليلترين من الخلايا عن طريق الدوامة. ثم نقل الخلايا تحت مسبار حقن العينة.

تأكد من أن الخلايا مشتتة بالتساوي عن طريق الفحص المجهري الضوئي. ثم حدد مخطط الرسم البياني على برنامج مقياس التدفق الخلوي لتسجيل بيانات مبعثر الضوء الأمامي. وانقر فوق السجل لعرض البيانات في مقياس سجل على المحور السيني.

في إخراج منفصل ، قم بتعيين رسم بياني آخر لمحور السجل لتسجيل التألق الطبيعي لخلايا M.aeruginosa. بعد ذلك ، حدد مصدر ضوء يمكنه إثارة الفيكوسيانين ، وكاشف يمكنه تصفية الانبعاثات من التألق الناتج. للتسجيل بأعلى دقة، حدد الإعدادات الأقرب إلى الحجم الأساسي للكائن الحي المستهدف.

وتعيين معدل تدفق بطيء نسبيا. قبل الحصول على البيانات ، قم بتعيين عتبة لإخراج أي إشارات تشتت ضوئية ومضان ناتجة عن ضوضاء الخلفية الإلكترونية أو حطام عينة الخلية. ثم حدد خلية بيانات جديدة.

قم بإنشاء مخطط كثافة باستخدام معلمات مبعثرة أمامية وجانبية على مقياس سجل، وانقر فوق تشغيل. الآن قم بتطبيق تشتت الضوء الأمامي وبوابة التألق الطبيعية على بيانات التشتت الأمامية جنبا إلى جنب لاستبعاد أي إشارات تشتت منخفضة المستوى ، ولتضمين إشارات فيكوسيانين الفلورية النسبية الأعلى فقط. ثم اجمع الأحداث حتى تنتهي العينة، واستخدم البيانات لتحديد عدد الخلايا الأولي.

لتحسين امتصاص خلية المسبار الجزيئي ، قم بتعريض نصف الزراعة الأحادية المعدة مسبقا للظروف المناسبة لتوليد تحكم ميت. تحقق من الاختلافات في البيئة الدقيقة للعينة لتأكيد موت الثقافة. ثم قم بتقسيم تكوين المستعمرة كما هو موضح للتو.

بعد ذلك ، حدد ليزر 488 نانومتر جنبا إلى جنب مع كاشف يمكنه تسجيل التألق من مجسات الحمض النووي الأخضر والبرتقالي. والليزر 640 نانومتر لتسجيل إشارات الفيكوسيانين من خلال أجهزة الكشف الخاصة بها. في ورقة بيانات جديدة، قم بإعداد مخطط كثافة مع معلمات التشتت الأمامية والجانبية.

ثم قم بإنشاء رسم بياني واحد باستخدام قناة الكاشف البصري للمسبار الجزيئي المعني. رسم بياني واحد للكشف عن انبعاثات الفيكوسيانين ، ورسم بياني واحد لأحداث التشتت الأمامي ، كل ذلك على مقياس لوغاريتمي. قم بتشغيل عينات البكتيريا الزرقاء باستخدام تركيزات وأوقات حضانة مختلفة.

قم بإنشاء بوابة في الرسم البياني للتبعثر الأمامي لتضمين الأحداث فقط مع حجم خلية الكائن الهدف. وقم بتطبيقه على قناة مسبار التألق المقابلة. بعد ذلك ، في قناة مسبار التألق ، قم بإنشاء بوابة برمجية شاملة أخرى مقابل أعلى قمة في الرسم البياني.

وبعد ذلك قم ببوابة مضان المسبار الموجب المقابل على مخطط الكثافة. قارن عدد إشارات التألق بعدد خلايا التحكم الميتة ، حيث تكون أعلى نسبة من امتصاص المسبار النووي للخلية لا ينتج عنه تلطيخ غير محدد. لاختبار تداخل التداخل الفلوري من تلطيخ الخلايا الجوهري أو غير المحدد ، حدد بيانات الثقافة المختلطة الحية و 50 في المائة الميتة بنسبة 50 في المائة.

وإزالة بوابات الفلورسنت. قم بتطبيق البوابات لتشمل فقط الرسم البياني للمبعثر الأمامي لحجم خلية الكائن الحي المستهدف على الرسم البياني لقناة فيكوسيانين. بوابات أعلى وأدنى قمم فيكوسيانين ، وتصنيفها على قيد الحياة والميتة ، على التوالي.

ثم قم بتطبيق البوابات بشكل منفصل على إشارات الفيكوسياانين الحية والميتة. وسجل كلا المتوسطين من الأطوال الموجية. لتحديد حساسية البروتوكول ، قم بمقارنة متوسط الأطوال الموجية للتألق الجزيئي الميت الموجب ، والإشارة الحية الجوهرية غير المحددة.

أخيرا ، حدد البروتوكول المحسن حيث تم تلطيخ أكبر كمية من الخلايا الميتة دون حدوث تلطيخ غير محدد. في هذه الرسوم البيانية ، يتم عرض مخرجات تشتت الضوء الأمامي والجانبي التمثيلي ، للحجم الخلوي والتعقيد الداخلي لثقافة دفعة M.aeruginosa في المرحلة الأسية. يمكن إجراء البوابات عن طريق تحسين البيانات بين نقاط معينة من إخراج مبعثر الضوء الأمامي.

ينتج فيكوسيانين إشارة قوية عند استجوابه بواسطة مصدر ضوء أحمر ، والذي يمكن استخدامه لزيادة بوابات السكان المهتمين. من إشارات تشتت الضوء الأمامي والفلورسنت ، يمكن بعد ذلك بوابات البيانات من الإخراج الأصلي ، إلى بيانات محددة على عينة M.aeruginosa لتعداد الخلايا النهائي. عندما يتم خلط عناصر التحكم الحية ذات الصبغة العالية والميتة ذات الصبغة المنخفضة ، يصبح التحول المتناقص في التألق التلقائي واضحا.

في الخلايا المعرضة للخطر بالغشاء ، تنتج مجسات الحمض النووي إشارة إضافية يمكن ملاحظتها عن طريق قياس التدفق الخلوي وتأكيدها بشكل أكبر عن طريق الفحص المجهري اللامع الفلوري. يزداد تمييز التألق بين الخلايا الحية والميتة بمرور الوقت بين تركيزات 0.05 و 0.5 ميكرومولار ، ولكنه ينخفض بين تركيزات واحد و 100 ميكرومولار لكلا المجسات. في الواقع ، يبدو أن التركيز الأمثل لمسبار الحمض النووي الأخضر هو 0.5 ميكرومولار مع وقت حضانة يبلغ 30 دقيقة.

بالنسبة لمسبار الحمض النووي البرتقالي ، يكون التركيز الأمثل هو ميكرومولار واحد لمدة 10 دقائق. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال التحسين لكل مسبار جزيئي في يوم واحد ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء المجسات في بيئة مستقرة ، تحت درجة الحرارة المناسبة ، ودرجة الحموضة ، وظروف الضوء.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف عدم تجانس المجتمع في العوالق النباتية. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية تطوير بروتوكول مثالي لتقييم علم وظائف الأعضاء الخلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجسات الجزيئية. لا تنس أن العمل مع المجسات الجزيئية والكائنات السامة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل ارتداء PPE المناسب ، والفهم الكامل لمواد COSHH ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.