في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثيرات أمراض التدفق النابض المختلفة على الخلايا البطانية. في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة الكيميائية أولا للشرائح الزجاجية وتغطيتها بالبروتين لضمان ارتباط الخلية أثناء التعرض للتدفق.

كخطوة ثانية ، يتم تحديد مؤشر النبض للتدفق ، مما يسمح بمقارنة التدفق في المختبر بالقيم الموضحة في الأدبيات. يتم توصيل الشرائح التي تجلس الخلية التالية بنظام التدفق من أجل قياس استجابة الخلية لأمراض التدفق. تظهر النتائج تغيرات في التشكل والتعبير عن البروتين بناء على ملامح التدفق باستخدام الفحص المجهري البصري والتلوين المناعي الفلوري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على المضخة التمعجية أو النابضة هي القدرة على ضبط نبض التدفق لتقليد الاستجابة المريضة أو الصحية. يمكن أن يساعد هذا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الشرايين. للبدء ، ضع شرائح زجاجية جديدة بقياس 75 ملم × 50 ملم × ملليمتر واحد في طبق تلطيخ زجاجي نظيف.

ثم أضف ما يكفي من محلول حامض الكبريتيك بنسبة 20٪ لغمر الشرائح الزجاجية بالكامل واحتضانها في المحلول الحمضي طوال الليل في اليوم التالي. اغسل الشرائح ثلاث مرات عن طريق غمرها في ماء منزوعة الأيونات لمدة خمس دقائق في كل مرة. بمجرد شطفها ، اغمر الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة ، ثم طوال الليل في محلول 6٪ من أمينو بروبيل تريكسي سيلين في الأسيتون.

بعد ذلك ، اشطف الشرائح ثلاث مرات في الأسيتون النقي لمدة خمس دقائق مع تغيير الأسيتون بعد كل غسلة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق ، مع تغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في 1.5٪ جلوتارالديهايد واتركها مغمورة لمدة 60 دقيقة.

بمجرد الربط المتقاطع ، اغسل الشرائح مرتين في ماء منزوع الأيونات ، وقم بتغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة ، ثم ضع الشرائح في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة لتعقيمها. قم بإزالة الإيثانول واترك أي بقايا متبقية تتبخر من الشرائح. بمجرد أن تجف ، أعد ترطيب الشرائح عن طريق وضعها لفترة وجيزة في ماء معقم منزوع الأيونات.

بعد ذلك ، قم بإزالة حامل الشريحة وضعه في طبق بتري 100 ملم × 100 ملم مربع. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتغطية الشريحة الوظيفية بمليلتر واحد من محلول فيبرونيكتين 25 ميكروغرام لكل مليلتر ، يغطي المنطقة التقريبية التي ستتعرض لغرفة زراعة الخلايا. ثم قم بتغطية الطبق واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين بعد الحضانة ، قم بشفط المحلول المتبقي وزرع 600،000 خلية بطانية في مليلتر واحد من DMEM مع 10٪ FBS على الجانب المطلي من الشريحة.

قم بتغطية الغرفة ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 120 دقيقة. ثم قم بتغطية الخلايا بوسيط إضافي واستمر في احتضانها حتى تصبح 70 إلى 80٪ ملتقية. قم بتوصيل دائرة التدفق كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب وكما هو موضح هنا ، تأكد من ترتيب غرفة التخميد ومقياس التدفق بالموجات فوق الصوتية في اتجاه التدفق الصحيح.

بعد ذلك ، املأ التدفق والدائرة والخزان بالماء منزوع الأيونات. تأكد من أن أنبوب مخرج الخزان مغمور داخل حجم الخزان. ثم تصور شكل موجة التدفق باستخدام مقياس التدفق.

افتح صمام تحرير الهواء في غرفة التخميد لتغيير نسبة السائل إلى حجم الهواء. أغلق صمام تحرير الهواء على فترات مختلفة من مستوى السوائل واحسب مؤشر النبض. لحساب الفهرس، قم بتقييم شكل موجة التدفق حيث تمثل الذروة الحد الأقصى للجهاز الظاهري.

يمثل الحوض الصغير v min ومتوسط V هو متوسط سجل الإشارة. قيم فهرس النبض في دفتر ملاحظات. ضع علامة على مستوى السائل الناتج ومؤشر النبض على حجرة التخميد باستخدام قلم حبر دائم مائل لباد للاستخدام في المستقبل.

حدد مستويات مؤشر النبض المطلوبة من أدبيات علم الأمراض المشار إليها في بروتوكول النص المصاحب أثناء تحضير إحماء غرفة التدفق. DMEM مكمل ب 1٪ FBS في حمام مائي 37 درجة مئوية. خذ إحدى الشرائح المطلية بالخلية من الوسائط بمجرد أن تتصادم بنسبة 70 إلى 80٪ وضع حشية أعلى جانب الخلية الجالس.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة قناة التفريغ لغرفة التدفق مع الفتحات الموجودة في الحشية. ثم قم بتوصيل أنابيب التفريغ بمنافذ التفريغ ، مما يضمن عدم تسرب الوسائط إلى الفراغ. ضع لوحا من البولي كربونات أسفل الشريحة الزجاجية وقم بتثبيت مجموعة غرفة التدفق بمشبك زنبركي واحد على كل جانب من الجانبين القصيرين ومشابك زنبركية على طول الجوانب الطويلة لغرفة التدفق.

بعد ذلك ، قم بتوصيل غرفة التدفق والمدخل والمخرج بدائرة التدفق. ضع نظام التدفق في حاضنة مثبتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون واملأ الدائرة بوسائط التسخين المسبق عن طريق ملء الخزان بالوسائط وضخها عند نبض منخفض. حافظ على هذا التدفق لمدة أربع ساعات لتكييف الخلايا مسبقا.

ثم اضبط حجم السائل في غرفة التخميد على مستوى مؤشر النبض المشار إليه مسبقا والثقافة. الخلايا للمدة المطلوبة. تم زراعة الخلايا البطانية الموضحة هنا بدون تدفق وتدفق ثابت وتدفق نابض.

يمكن رؤية التغييرات في التشكل من مورفولوجيا الخلية البطانية النموذجية إلى مورفولوجيا أكثر شبها بالمغزل بعد 24 ساعة من التعرض لتدفق نابض عالي. في حين أن كلا من التدفق الثابت والثابت يظهران اختلافا طفيفا أو معدوما في التشكل. تتأثر خلايا العضلات الملساء أيضا بالزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية المعرضة لتدفق نابض عال كما هو موضح هنا من خلال مستويات مختلفة من أكتين العضلات الملساء ألفا وسلسلة الميوسين الثقيلة.

خلال ظروف التدفق المتغيرة ، أظهرت الخلايا التي تعرضت للتدفق النابض أكبر كميات من كلا البروتينين ، مما يدل على التضخم والانقباض. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على جميع موانع التسرب والتأكد من بقاء مستويات السوائل ثابتة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الخلايا البطانية والزراعة المشتركة لخلايا الأوعية الدموية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تفاعلات الخلية إلى الخلية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع دائرة التدفق ، والتحكم في الفهرس ، وتعريض الخلايا البطانية للتدفق النابض.